荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）作为一种典型嗜冷性细菌，是引起冷藏水产品腐败的优势腐败菌[1]。其致腐能力由N－酰基高丝氨酸内酯（N－Homoserine lactone，AHLs）类信号分子介导的群体感应系统调控[2]。研究表明，荧光假单胞菌蛋白酶的分泌、鞭毛的运动和生物膜的形成受C4－HSL、C6－HSL、3－HO－C4－HSL、3－HO－C8－HSL 等AHLs 信号分子的调控[3－5]。群体感应系统成为控制荧光假单胞菌污染食品新的潜在靶点。
群体感应（Quorum sensing，QS）是一种广泛存在于微生物体内的细胞间通讯系统，细菌通过自身诱导物（Autoinducer，AI）的分泌、检测和反应，激活包括毒力机制和耐药机制在内的各种下游细胞过程，使其释放毒力因子，产生致腐性并耐受抗生素从而损害宿主[6]。群体感应淬灭（Quorum quenching，QQ）是指对细菌的群体感应系统进行干预，对菌落内及菌落间的通讯进行拦截，以及降低细菌毒素的产生及释放[7－9]。研究表明，大多数群体感应抑制剂的作用模式是：1）抑制细菌自身诱导物的合成；2）对细菌产生的自身诱导物进行酶解；3）与环境中的自身诱导物竞争受体的结合位点；4）干扰自身诱导物与基因启动子的结合[10]。考虑到群体感应抑制剂的效率和细菌的耐药性，群体淬灭酶被认为是目前最理想的群体感应抑制剂[11]。
群体淬灭酶主要包括AHLs 内酯酶、AHLs 酰基转移酶和氧化还原酶。Dong等[12]从芽孢杆菌（Bacillus）240B1 中克隆 出世界上第1 个编码AHLs 内酯酶基因aiiA，并发现内酯酶AiiA 可以有效减弱软腐病相关病原菌的致病性。随后，大量研究表明编码酰基转移酶的基因广泛地存在于芽孢杆菌属中，如Nithya等[13]在对海洋沉积物来源的微生物进行QQ 菌筛时，获得1 株产AHLs 酰基转移酶的短小芽孢杆菌S8－07，发现其对铜绿假单胞菌的信号分子的积累具有明显抑制作用，且能有效抑制铜绿假单胞菌和粘质沙雷氏菌毒力因子的表达。此外，巨大芽孢杆菌产生的AHLs 氧化还原酶P450BM－3 能催化AHLs 裂解[14]。目前关于具有群体感应淬灭活性芽孢杆菌的研究主要集中在防控植物致病菌方面，而其对水产品腐败菌荧光假单胞菌群体系统的淬灭作用及生物膜的抑制研究并不深入。
本文采用双层琼脂扩散法验证菌株YF－2 对荧光假单胞菌的群体感应淬灭活性。通过热灭活和酸敏感试验分析淬灭活性物质类型。采用结晶紫定量法和激光共聚焦技术探究淬灭活性物质对荧光假单胞菌生物膜的抑制效果和清除作用。本文旨在从丰富的芽孢杆菌资源中寻找安全、高效的群体感应淬灭菌，研究其对荧光假单胞菌群体感应系统的淬灭效果，为控制水产腐败菌提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）YF－2，分离自辽宁朝阳泡菜；荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）分离自腐败大菱鲆；紫色杆菌（Chromobacterium violaceum）CV0266 为紫色杆菌ATCC 31532 的mini－Tn5 突变体，菌株自身不产生AHLs，仅当外源AHLs 存在时，可产生特征性紫色菌素，检测酰基侧链长度为C4～C8 的信号分子。以上菌株均保藏于本院微生物实验室。
琼脂粉、LB 肉汤、LB 固体，青岛海博生物技术有限公司；硫酸卡那霉素，上海碧云天生物技术有限公司；冰醋酸、乙酸乙酯、甲醇，北京伊诺凯科技有限公司；无水乙醇，山东普利斯化工厂；磷酸盐缓冲液、2.5%戊二醛，飞净生物科技有限公司；生理生化鉴定管，杭州微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA 快速抽提试剂盒、aq PCR Master mix、4S GelRed 核酸染料、DNA marker－D，上海生工生物工程有限公司；AO/EB 双荧光染色试剂盒，北京雷根生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
BSA224S 电子分析天平，德国sartorius 集团；AZ8601 便携pH 计，台湾衡欣科技股份有限公司；ZX－400 型全自动菌落计数仪，杭州泽析生物；JY92－IIDN 超声破碎仪、Scientz－WSQ 全自动微生物生长曲线分析仪，宁波新芝生物；PCR 仪，德国Eppendorf 公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司；凝胶成像系统、酶标仪，美国Bio－Rad 公司；UV2550 紫外－可见分光光度计，日本岛津公司；Leica TCS SP5 激光共聚焦显微镜，德国徕卡显微系统；GI54DS 致微高校专用高压灭菌器，福建致微仪器有限公司；HealForceOptiClean1300 洁净工作台，香港力康集团；SHP－360D 生化培养箱，上海森信实验仪器有限公司；N－1300V－WB 旋转蒸发仪，东京理化器械株式会社；LC－WB－4 恒温水浴锅，力辰科技。
1.3 方法
1.3.1 菌种活化 将菌株YF－2 以2.0%（体积分数）接种于LB 肉汤中，于37 ℃，24 h 条件下传代培养后使用。紫色杆菌CV026 和荧光假单胞菌以1.0%（体积分数）接种于LB 肉汤中，于30 ℃培养24 h，传代培养3 次。其中，紫色杆菌CV026 培养时需在LB 培养基中添加终浓度为34.33 μmol/L·d 的卡那霉素。
1.3.2 荧光假单胞菌AHLs 信号分子粗提物的制备 参考丁婷[15]的方法，将荧光假单胞菌培养物于4 ℃，8 000 r/min 离心10 min，收集上清液，并用0.22 μm 滤膜抽滤。取100 mL 滤液于分液漏斗中，使用等体积含有0.01%冰醋酸的乙酸乙酯萃取，摇匀，静置5 min 后萃取，收集乳化层液体，置于50 ℃、120 r/min 条件下旋转蒸发，直至蒸发瓶中无乙酸乙酯气味，样品干燥。用体积分数70%的甲醇溶液溶解干燥物，得到荧光假单胞菌AHLs粗提物，存于－20 ℃冰箱备用。
1.3.3 菌株YF－2 群体淬灭活性验证 参考Cui等[16]的方法,将1 mL 菌株YF－2 的3 代培养物（pH 7.0）与10 μL 荧光假单胞菌AHLs 粗提物混合，于30 ℃培养24 h，离心收集上清液。采用琼脂扩散法法检测菌株YF－2 的群体感应淬灭活性。
1.3.4 群体淬灭活性物质位置及类型确定 参考Torres等[17]的方法并稍作修改，取40.0 mL 菌株YF－2 培养物于4 ℃，10 000 r/min 离心5 min，得无细胞上清液（Cell free supernatants，CFS）和菌体沉淀。菌体沉淀用PBS（pH 6.5）缓冲液洗涤2次后重悬于10.0 mL PBS（pH 6.5）中，于冰水浴中间歇超声破碎5 min，离心收集上清液，上清液经0.22 μm 滤膜过滤，即菌株YF－2 的细胞提取物（Crude cell extract，CCE）。
取1.0 mL 菌株YF－2 菌悬液、CFS、CCE 和热灭活的CCE（100 ℃灭活30 min）与C4－HSL（终浓度为10 mmol/L）混合，于30 ℃培养24 h，4 ℃，10 000 r/min 离心5 min，收集共培养物上清液，采用琼脂平板扩散法检测剩余C4－HSL 含量。以PBS为阴性对照，未灭活的的CCE 为阳性对照。
参考Romero等[18]的方法分析菌株YF－2 分泌的淬灭活性物质类型。取1.0 mL CCE 与C8－HSL（终浓度为10 mmol/L）混合，于30 ℃培养24 h，离心收集共培养物上清液，采用琼脂平板扩散法检测剩余C8－HSL 含量。用1.0 mol/L HCl 调节剩余共培养物上清液的pH 值至2.0，30 ℃下培养24 h后，调节混合物pH 值至7.0，再用琼脂平板扩散法检检测其C8－HSL 含量。
1.3.5 菌株YF－2 对紫色杆菌CV026 生长的影响参考李欣蔚[19]的方法测定菌株YF－2CCE 的蛋白含量。将2 代菌悬液稀释至106 CFU/mL，取180 μL 紫色杆菌CV026（106 CFU/mL）菌悬液至96 孔板中，随后加入20 μL CCE，使其蛋白终质量浓度分别为10，20，40，80 μg/mL 及160 μg/mL，且以等量PBS 缓冲液为阴性对照，30 ℃培养24 h，每隔2 h 测定其OD595nm 值。
1.3.6 菌株YF－2 对AHLs 标品的降解作用 将C4－HSL、C6－HSL 和C8－HSL 信号分子标品分别与菌株YF－2 的CCE（10，20，40，80 μg/mL 及160 μg/mL）混合，使AHLs 标品终浓度为10 mmol/L，于30 ℃共培养24 h，4 ℃，10 000 r/min 离心5 min收集共培养物上清液，采用琼脂平板扩散法检测剩余AHLs 含量，以PBS 缓冲液为阴性对照。
1.3.7 菌株YF－2 对荧光假单胞菌生物膜的影响
1）生物膜抑制 在96 孔板中，将菌株YF－2 CCE 添加到含有荧光假单胞菌（600 nm 处OD值为0.8）的LB 肉汤中，使其蛋白终质量浓度分别为20，40 μg/mL 和80 μg/mL，30 ℃培养24 h 后，取上层液体检测荧光假单胞菌存活情况，用PBS缓冲液缓慢清洗孔3～5 次，加入结晶紫进行染色处理，用PBS 缓冲液缓慢冲洗5～8 次，烘干处理10～15 min，最后加入200 μL 33%冰醋酸，595 nm处的OD 值即生物膜相对含量。
2）生物膜清除 在96 孔板中对荧光假单胞菌进行传代培养，30 ℃培养24 h 后吸出孔中悬浮液，用PBS 缓冲液冲洗孔3～5 次。向孔内添加蛋白终质量浓度分别为20，40 μg/mL 和80 μg/mL的菌株YF－2CCE，于30 ℃培养24 h 后，按1.3.7节方法分析生物膜含量。
3）浮游细胞存活率 将100 μL 荧光假单胞菌悬浮液离心，取沉淀，重悬于0.85%生理盐水，选取合适梯度涂布计数。
4）激光共聚焦显微镜分析 将大小一致的无菌玻璃片提前置入24 孔板中，按上述方法用菌株YF－2 CCE 抑制或清除荧光假单胞菌生物膜。用PBS 缓冲液冲洗载玻片3～5 次后，用2.5%的戊二醛溶液在4 ℃下固定生物膜30 min。固定后用AO/EB 双染液染色15 min，然后用无菌PBS 缓冲液洗涤3 次，干燥30 min，加入10 μL 抗荧光淬灭封片剂，用激光共聚焦显微镜进观察。观察条件：发射波长525 nm，激发波长488 nm，放大倍数10×。生物被膜的三维结构用Leica TCS SP5 软件绘制。
1.3.8 菌株鉴定 形态学观察：对菌株YF－2 进行划线纯化，待平板中有单菌落形成后观察菌株YF－2 的形态，同时进行革兰氏染色试验。生理生化反应：参照文献[20]对菌株YF－2 进行生理、生化鉴定。16S rDNA 核酸序列分析：取菌株YF－2 3代培养物1.0 mL，4 ℃，10 000 r/min 离心5 min，参考孙梦桐等[21]的方法进行16S rDNA 测序。
2 结果与分析
2.1 菌株YF-2 对荧光假单胞菌群体淬灭活性的验证
采用琼脂平板扩散法验证菌株YF－2 对荧光假单胞菌AHLs 粗提物的淬灭活性。如图1a 所示，菌株YF－2 对荧光假单胞菌AHLs 粗提物的降解率达100%，淬灭活性良好，可进行后续试验。
图1 菌株YF-2 对荧光假单胞菌群体淬灭活性验证及淬灭活性物质位置和类型的确定
Fig.1 Validation of QQ activity of strain YF－2 against P.fluorescens and determination of the location and types of QQ active substances
2.2 菌株YF-2 淬灭活性物质的位置及类型确定
由图1b 可知，与对照相比，菌株YF－2 菌悬液对C4－HSL 具有淬灭活性，降解率未达100%。CFS 对C4－HSL 没有淬灭作用，CCE 对C4－HSL 的降解率为100%。结果表明，菌株YF－2 对C4－HSL具有淬灭活性且淬灭活性物质存在于CCE 中。崔天琦等[22]在探究清酒乳杆菌YP4－1－1 的淬灭活性位置时发现，相较于菌株YP4－1－1 的CFS，菌株YP4－1－1 的CCE 对嗜水气单胞菌AHLs 的淬灭效果较好，本研究结果与其相似。选择菌株YF－2 的CCE 进行后续研究。
图1c 为菌株YF－2 的CCE 经100 ℃灭活30 min 后对C4－HSL 的淬灭活性。与未灭活的对照组相比，菌株YF－2 的CCE 经热处理对C4－HSL 的淬灭活性消失。结果表明，菌株YF－2 CCE 中的淬灭活性物质热稳定性差，高温易失活，推测其可能是酶类物质。
在群体感应淬灭酶中，内酯酶通过水解AHLs的内酯环发挥作用，然而，酸性条件下内酯环的降解是可逆的，酰基转移酶不可逆地水解酰基链和AHL 环之间的酰胺链，产生相应的游离脂肪酸和高丝氨酸内酯[23－24]。氧化－还原酶通过氧化或还原第3 碳位置上的酰基侧链来不可逆地改变AHLs的化学结构[25]。如图1d 所示，将被菌株YF－2 淬灭物质降解的C8－HSL 置于酸性条件后，C8－HSL 活性部分恢复，产生紫色显色圈，然而，与对照相比差异不显著。由此可知，菌株YF－2 CCE 中淬灭物质除含有内酯酶外，可能还含有酰基转移酶或氧化还原酶。
2.3 菌株YF-2 CCE 对信号分子标品的降解
图2a 为添加不同蛋白质量浓度CCE 时紫色杆菌CV026 的生长曲线。紫色杆菌CV026 呈现S型特征生长曲线，说明所选菌株YF－2 CCE 蛋白质量浓度对紫色杆菌CV026 的生长无影响。
图2 菌株YF-2 CCE 对紫色杆菌CV026 生长的影响（a）及对AHLs 标品的降解效果（b、c）
Fig.2 Effects of strain YF－2 CCE on the growth of C.violaceum CV026（a）and degradation of AHLs standard（b，c）
注：A、B、C、D 及a、b、c 表示不同蛋白质量浓度YF－2 CCE 处理具有显著性差异（P＜0.05）。
蛋白质量浓度分别为10，20，40，80 μg/mL 及160 μg/mL CCE 对AHLs 标品（C4－HSL、C6－HSL及C8－HSL）的降解效果如图2b～2c 所示。菌株YF－2 CCE 对C4－HSL 和C6－HSL 的降解效果呈浓度依赖性，且当质量浓度达80 μg/mL 后，CCE可完全降解C4－HSL 和C6－HSL 信号分子。此外，在所选CCE 蛋白质量浓度下对C8－HSL 的降解率均为100%。结果表明，菌株YF－2 CCE 在不影响紫色杆菌CV026 生长的情况下，对AHLs 具有显著的淬灭效果。为了探究CCE 对荧光假单胞菌群体感应系统的干扰作用，选择蛋白质量浓度20，40 μg/mL 和80 μg/mL 的CCE 对荧光假单胞菌生物膜进行抑制和清除作用研究。
2.4 菌株YF-2 CCE 对荧光假单胞菌生物膜的影响
2.4.1 定量分析 生物膜的形成涉及寄主与非生物表面、生物膜中的病原体、细胞外聚合物基质和周围的生物液之间复杂的动态相互作用。生物膜形成后，附着强度和黏弹性使其难从表面去除，抵抗力的增强使得微生物对抗菌剂具有耐受性[26]。研究表明，荧光假单胞菌生物膜的形成受其群体感应系统的调控[27]。菌株YF－2 CCE 对荧光假单胞菌生物膜的抑制作用如图3a 所示，蛋白质量浓度20，40 μg/mL 和80 μg/mL 的CCE 对生物膜生成的抑制率在25.84%～56.63%。菌株YF－2 CCE对荧光假单胞菌生物膜的抑制效果具有质量浓度依赖性。对浮游细胞测定结果显示（图3b），菌株YF－2 CCE 在拮抗荧光假单胞菌生物膜形成时，不影响其浮游细胞的正常生长，表明菌株YF－2 CCE 对荧光假单胞菌的生长没有抑制作用。Raafat等[28]发现经蜡样芽孢杆菌30b 菌株无细胞裂解液处理的铜绿假单胞菌PAO1 的生物膜形成量减少72%～86%，且不影响浮游细胞存活率，本研究结果与其相似。
图3 定量分析菌株YF-2 CCE 对荧光假单胞菌生物膜的抑制（a）、浮游细胞的影响（b）及对荧光假单胞菌生物膜清除（c）作用
Fig.3 Quantitative analysis of strain YF－2 CCE on P.fluorescens biofilm inhibition（a）and the effect of planktonic cells（b）and the clearance of P.fluorescens biofilm（c）
注：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
图3c 为菌株YF－2 CCE 对已形成荧光假单胞菌生物膜的清除效果，蛋白质量浓度20，40 μg/mL 和80 μg/mL 的CCE 对荧光假单胞菌生物膜的清除率分别为26.12%，30.54%和59.35%，说明菌株YF－2 具有一定的生物膜清除能力。
2.4.2 激光共聚焦显微镜分析 当微生物附着在物体表面和彼此之间时，通常会形成多层生物膜，用激光共聚焦显微镜可以进一步观察生物膜三维结构[29]。荧光假单胞菌活/死细胞用特异性荧光标记进行染色。活细胞发出绿色荧光，死亡和受损细胞发出红色荧光。菌株YF－2 CCE 对荧光假单胞菌生物膜的抑制作用如图4 所示。对照组生物膜结构致密完整，厚度为26 μm，几乎没有死菌。随着菌株YF－2 CCE 浓度的提高，所形成的生物膜结构越来越不完整，厚度从26 μm 减到7 μm，膜结构被破坏。这一结果与生物膜定量分析结果一致，表明3 个蛋白质量浓度下的菌株YF－2 CCE对荧光假单胞菌生物膜的形成有一定的抑制作用。Devi等[30]将枯草杆菌R－18 提取物处理和未处理的粘质链霉菌生物膜在激光共聚焦显微镜观察，与对照相比，处理组的生物膜厚度减少。这表明枯草杆菌R－18 提取物干扰了粘质链霉菌的群体感应系统，导致生物膜的破坏。与本研究结果相似。
图4 激光共聚焦显微镜分析菌株YF-2 CCE 对荧光假单胞菌生物膜的抑制作用
Fig.4 Confocal laser scanning microscope analysis of inhibition on P.fluorescens biofilm by strain YF-2 CCE
注：x 表示生物膜宽度；y 表示生物膜长度；z 表示生物膜厚度。
2.5 菌株鉴定
图5a 显示菌株YF-2 在LB 固体培养基上呈圆形或近似圆形，个体较大，黄色，有光泽，为不透明的凸起菌落，其质地柔软。菌株经革兰氏染色后，在光学显微镜下呈蓝紫色（图5b），杆状，菌体单个或长链状排列，属革兰氏阳性菌。表1 为菌株YF-2 的生理、生化鉴定结果。根据文献[18]和形态学分析，可预判菌株YF-2 为蜡样芽孢杆菌。
表1 菌株YF-2 的生理、生化鉴定结果
Table 1 Physiological and biochemical identification results of strain YF-2
注：“+”表示阳性；“－”表示阴性。
图5 菌株YF-2 在平板（a）及光学显微镜（b）下的形态（革兰氏染色，1 000×）和16S rDNA 基因扩增电泳图（c）及16S rDNA 系统发育树（d）
Fig.5 Morphology of strain YF－2 under plate（a）and light microscope（b）（Gram Staining，1 000×）and 16S rDNA gene amplification electropherogram（c）and 16S rDNA phylogenetic tree（d）
图5c 为菌株YF-2 的16S rDNA 基因扩增电泳图，可知菌株YF-2 的标片段被成功扩增，且PCR 产物在1 500 bp 附近出现特征条带。将扩增产物送至上海生工测序分析，通过NCBI 数据库比对测序结果并构建系统发育树（图5d）。菌株YF-2 与Bacillus cereus（MN691546.1）亲缘关系最近，显示100%同源性，因此可鉴定菌株YF-2为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。
3 结论
本研究获得1 株对荧光假单胞菌群体感应系统淬灭效果良好的蜡样芽孢杆菌YF－2，通过热灭活和酸敏感试验初步确定淬灭酶存在于菌株YF－2 的无细胞提取物中，为酰基转移酶或氧化－还原酶。蛋白质量浓度为20，40 μg/mL 和80 mg/mL 的淬灭酶对C4－HSL、C6－HSL 及C8－HSL 具有良好的淬灭效果，对荧光假单胞菌生物膜的抑制率和清除率分别为25.84%～56.63%和26.12%～59.35%，且不影响浮游细胞的存活率。激光共聚焦显微镜分析发现，经蜡样芽孢杆菌YF－2 淬灭酶处理后荧光假单胞菌生物膜厚度减少，且膜结构被破坏。综上，蜡样芽孢杆菌YF－2 淬灭酶对荧光假单胞菌群体感应系统具有干扰作用且能抑制生物膜的形成。
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