自由基是正常细胞的代谢产物，在活细胞中持续产生，最常见的即超氧阴离子自由基、羟基自由基和过氧化自由基等活性氧自由基。自由基在低浓度时可以在生命系统中发挥积极作用，例如预防感染性病原体的入侵。当自由基浓度过高时，使生物体中促氧化剂/抗氧化剂反应平衡状态被打破，从而发生氧化应激反应，损害细胞脂质、蛋白质和DNA[1-2]。过量自由基的存在还可引起β 胰岛细胞的氧化损伤，诱导Ⅱ型糖尿病的发生[3]。与此同时，自由基还与衰老、炎症、心脑血管疾病、癌症等疾病的发生密切相关[4]。生命体细胞中内源性抗氧化剂主要有还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、SOD 和CAT 等酶类物质[5]，也可摄入外源性抗氧化物质以抵抗氧化损伤，由于合成抗氧化剂往往具有潜在毒性，因此人们致力于寻求天然抗氧化剂，例如，多酚类物质[6]、植物和动物蛋白水解肽类[7-8]及多糖类[9]物质的开发应用。其中，抗氧化肽是所有天然生物活性肽的重要分支，也是抗氧化制剂探索的热潮领域，不仅具有易吸收、较稳定、不引起免疫反应的特点，还能有效提高蛋白生物利用度，解决蛋白溶解特性限制问题，满足于不同食品、药品工业的应用需求[10-11]。一些文献报道了有关各类谷物蛋白水解肽的抗氧化活性，如糯米抗氧化肽[12]、小麦胚芽肽[13]、玉米肽[14]等，不同多肽发挥抗氧化活性作用与其自身的氨基酸组成和序列密切相关。
荞麦是廖科荞麦属的成员，在亚洲、欧洲、北美等地广泛种植，其种类繁多，以普通荞麦的种植最为普遍[15]。荞麦籽粒含有丰富的维生素B1 和B2、赖氨酸、蛋白质、黄酮类、植物甾醇、荞麦醇和硫胺素等，被认为是一种高营养价值的无麸质谷物[16]。近年来，各国学者对荞麦中各类抗氧化活性物质进行了研究，例如，Gabr 等[17]研究发现荞麦中类黄酮含量增加与抗氧化活性提高呈正相关。Zhu等[18]发现小荞麦中的游离酚较结合酚具有更强的自由基清除能力。刘瑶等[19]提取荞麦皮多糖，探究其对铁氰化钾的还原能力及羟基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH）的自由基清除能力。对荞麦蛋白的研究方面，有文献证实荞麦蛋白水解肽具有抗氧化能力（超氧阴离子、羟基自由基和DPPH 自由基的清除）[20-21]。基于上述研究，荞麦多肽有可能成为天然抗氧化剂的重要来源。
本研究以植物乳杆菌和嗜热链球菌两种益生菌为发酵菌株，与荞麦发酵常用菌种[22-23]相比，乳酸菌能产生广谱蛋白水解酶，蛋白切割位点广泛，可产生功能性小分子活性肽[24]。以益生菌发酵法制备得到的荞麦抗氧化多肽为对象，利用原料的物质多样性可为微生物生长代谢提供丰富营养源的特点，将蛋白在微生物发酵作用下生成小分子多肽，采用传统化学抗氧化评价方法，结合H2O2诱导RAW 264.7 巨噬细胞建立氧化损伤模型，研究荞麦多肽在化学和细胞水平的抗氧化活性，为开发天然食品抗氧化剂提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
原料：荞麦（Fagopyrum esculentum Moench），产自山西省朔州市，由山西众恬农业科技有限公司提供。
菌株：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，CICC 20283）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus，CICC 6220），中国工业微生物保藏中心。
试剂：超低分子质量标准蛋白Marker，北京索莱宝科技有限公司；DPPH，上海宝曼生物科技有限公司；2，2'-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸），上海麦克林生化科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），杭州四季青生物工程有限公司；DMEM（dulbecco's modified Eagle's medium）高糖培养基，吉诺生物医药技术有限公司；双抗（青霉素-链霉素）溶液，生工生物工程（上海）股份有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞增殖-毒性检测试剂盒，兰杰柯科技有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、ROS 测定试剂盒、SOD 测定试剂盒、MDA 测定试剂盒、CAT 测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；色谱级乙腈，西班牙萨劳有限公司；其它试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
HD-5 型电脑紫外检测仪，上海青浦沪西仪器厂；UV-2600 型紫外分光光度计，日本岛津公司；Waters-2695 型高效液相色谱仪，美国Waters 公司；Spectramax iD3 型多功能酶标仪，美谷分子仪器有限公司；Mini-PROTEAN 型电泳仪，美国Bio-Rad 公司；Nicolet 型傅里叶红外光谱仪，美国尼高力仪器公司；IX51 型倒置显微镜，日本OLYMPUS公司；IC-1000 型细胞计数仪，艾力特生命科学（上海）有限公司；TGL-16gR 型台式高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 粗荞麦多肽的制备 荞麦于4 ℃条件下浸泡12 h，打浆，于90 ℃条件下糊化1 h 后0.07 MPa 121 ℃条件下灭菌，制备无菌荞麦浆液。经前期试验，选择植物乳杆菌和嗜热链球菌作为发酵菌株，将菌株活化两次至对数生长期，将活化完成后的细菌4 000 r/min 离心10 min，弃上清，菌体用无菌生理盐水洗涤3 次后重悬，调整细菌菌量为106～107 CFU/mL（λ=600 nm，OD=0.80）。两菌株按体积比1∶1，体积分数3%的接种量接种于无菌荞麦浆中，在37 ℃下发酵3 d，发酵浆液以8 000 r/min 离心15 min，上清液减压浓缩后冷冻干燥得到粗荞麦多肽。
1.3.2 分离纯化
1.3.2.1 Sephadex G-25 分离 利用葡聚糖凝胶柱分离小分子肽的方法[25]，将葡聚糖凝胶于4 ℃条件下浸泡过夜，使其充分溶胀，取出后煮沸30 min 以排尽凝胶孔隙中的气泡，冷却至室温，装柱（1.6 cm×60 cm），用超纯水平衡柱床至电脑检测端基线处于水平位置。粗荞麦多肽过0.22 μm 滤膜后上样，用超纯水洗脱，控制流速为1.5 mL/min，紫外检测仪于280 nm 波长处检测吸光值，利用自动收集装置收集样品。
1.3.2.2 RP-HPLC 纯化 将葡聚糖凝胶分离得到的活性组分进一步用RP-HPLC 分离纯化。流动相：A 为 含0.1% TFA的超纯水，B 为含0.1%TFA的乙腈；色谱柱：BioBasic-18色谱柱（250 mm×4.6 mm，300 Å，5 μm）；进样量：50 μL；检测波长：220 nm；洗脱条件：0～5 min，90% A；5～20 min，90%～70% A；20～30 min，70%～50% A；30～35 min，50%～10% A；35～40 min，10%～90% A。重复上样，收集活性组分，制备得到BAPs。
1.3.3 分子质量测定 采用Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳测定多肽分子质量的方法[26-27]，并做适当修改。依次配制20%T、10%T、4%T 的分离胶、夹层胶和浓缩胶。取3.5 mL 分离胶于两玻璃板间，并用1 mL 超纯水覆盖，使凝胶表面保持平整，当凝胶完全聚合后，用滤纸吸去上层水分，再迅速取0.7 mL 夹层胶于分离胶上面，重复上述过程，最后加入浓缩胶至短玻璃板平齐，插入梳子，凝胶聚合后拔出梳子，制胶完成。一定浓度的BAPs 加入上样缓冲液后和标准蛋白Marker 一起放入水浴锅内，沸水浴10 min，取出后立即上样10 μL。首先采用40 V 的起始电压电泳至指示剂到达分离胶，随后升高电压至110 V，指示剂到达分离胶底部后停止电泳，整个电泳过程持续时间约5 h。
1.3.4 红外光谱分析 称取10 mg 样品加入1 g干燥KBr，研磨后压片，用红外光谱仪进行扫描，扫描波段为400～4 000 cm-1，扫描次数20 次，分辨率为4 cm-1。
1.3.5 体外抗氧化
1.3.5.1 DPPH·清除能力测定 参考Aondona等[28]测定DPPH·清除率的方法，用无水乙醇配制0.1 mmol/L 的DPPH 溶液，取适宜浓度样品1 mL加入等体积DPPH 溶液，摇匀，置于暗处反应30 min，在517 nm 处测定吸光值。分别配制浓度为11.36，22.72，30.04，45.44，56.80 μmol/L 的VC 溶液，按上述方法测定DPPH·清除率，以DPPH·清除率为纵坐标，VC 浓度为横坐标绘制标准曲线得到线性方程y=1.32x+16.39，R2=0.999。通过比较半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50），计算样品的VCEAC[29-30]，以单位μg/mg 表示。
式中：A0 为含样品和DPPH 吸光值；A1 为含样品无DPPH 吸光值；A2 为无样品含DPPH 吸光值；A3 为无样品和DPPH 吸光值。
1.3.5.2 ABTS+·清除能力测定 参考Chang 等[31]的测定方法，配制浓度分别为7 mmol/L 的ABTS和2.45 mmol/L 过硫酸钾溶液，按体积比1 ∶1 混合，混合溶液室温避光放置12～16 h 形成ABTS 储备溶液，用前用蒸馏水稀释，使其在734 nm 处吸光值为0.70±0.02，得到ABTS 工作液。将20 μL 的样品加入至200 μL ABTS 工作液中，避光孵育10 min，在734 nm 处测定吸光值。测定VC 在浓度56.80，113.56，170.34，227.12，283.90 μmol/L 时 对ABTS+·的清除能力，绘制线性曲线，线性方程为y=0.26x-6.77，R2=0.993，通过IC50 计算样品VCEAC。ABTS+·清除率计算公式同1.3.5.1 节。
1.3.5.3 ·OH 清除能力测定 采用邢珂慧[32]的方法，取浓度适宜的样品溶液1 mL，向样品溶液中加入1 mL 浓度为6 mmol/L 的FeSO4 溶液（现配现用），再加入体积分数为3%的H2O2 溶液1 mL，样品空白组用蒸馏水代替，随后加入1 mL 浓度为9 mmol/L 的水杨酸-乙醇溶液，再加入1 mL 水，于517 nm 处测定吸光值。测定VC 浓度在1.42，2.84，5.68，11.36，17.04 mmol/L 时对·OH 的清除率，得到线性方程y=5.08x+1.09，R2=0.999，以IC50为标准，计算VCEAC。羟基自由基清除率计算公式同1.3.5.1 节。
1.3.5.4 还原力测定 参考文献[33]中的方法，并做适当修改，0.5 mL 样品中加入0.5 mL 质量分数为1%的铁氰化钾溶液和0.2 mol/L（pH=6.6）的磷酸盐缓冲液，50 ℃水浴20 min，冰水浴冷却，再加入0.5 mL 质量分数为10%的三氯乙酸溶液，涡旋混匀，8 000 r/min 离心10 min，取上清液1 mL 加入1 mL 质量分数为1%的三氯化铁溶液，空白组由水代替，于700 nm 处测定吸光值，还原力由吸光值表示。测定0.11，0.23，0.45，0.68，0.91 mmol/L浓度下VC 的还原力，得到标准曲线方程y=1.83x+0.24，R2=0.999，以1 mg/mL 质量浓度下样品的还原能力值计算VCEAC[34]。
式中：A1 为样品组吸光值；A0 为样品空白组吸光值。
1.3.6 BAPs 抑制H2O2 致RAW 264.7 细胞氧化损伤试验
1.3.6.1 细胞培养 RAW 264.7 细胞冻存管从液氮中取出后，至37 ℃水浴锅中迅速融化，细胞悬液转移至离心管中并加入1 mL DMEM 高糖培养基（含体积分数为10%的FBS、体积分数为1%的青霉素-链霉素双抗），小心摇匀后离心去上清，再加入2 mL 完全培养基将细胞吹散均匀，置于含8 mL 完全培养基的细胞培养皿中，于5% CO2、37℃培养箱中培养，每48 h 更换新的细胞培养液，取连续传代4～6 代后的细胞用于试验。
1.3.6.2 氧化应激模型的建立及BAPs 安全剂量的确定 氧化应激模型的建立：将培养好的RAW 264.7 细胞以1×105 个/mL 的密度接种于96 孔板中，每孔100 μL，于5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h 后吸弃培养基，加入含H2O2（终浓度为100，200，300，400，500，600 μmol/L）的新鲜培养基处理2 h，参考王晶波等[35]的方法，用CCK-8 法测定细胞存活率，细胞存活率在50%左右时可以认为细胞处于氧化应激状态，对应的H2O2 浓度为建立氧化应激模型的最适浓度。
荞麦对RAW 264.7 细胞的毒性作用：接种于96 孔板中的细胞培养24 h 后，换用含荞麦多肽（终浓度为50，100，200，400，800 μg/mL）的无血清培养基继续培养细胞24 h，CCK-8 法测定细胞存活率。
式中：A试验组为细胞经H2O2 或药品处理后加CCK-8 试剂测定的吸光度值；A对照组为细胞未经任何处理正常培养状态下加CCK-8 试剂测定的吸光度值；A空白组空白组为没有细胞只加入CCK-8 试剂测定的吸光度值。
1.3.6.3 BAPs 对H2O2 诱导的氧化损伤RAW 264.7 细胞存活率的影响 参考Qin 等[36]报道的试验方法并做适当修改。根据1.3.4.2 节的方法对细胞进行接种培养及药物处理，吸弃培养基后用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）小心洗涤2 次，加入含500 μmol/L H2O2 的新鲜培养基继续处理2 h 后测定细胞活力，考察药物对H2O2 损伤的抑制作用。
1.3.6.4 细胞ROS 水平、SOD、MDA 及CAT 活力测定 细胞ROS 水平测定：采用黑色96 孔板培养细胞，细胞接种及药物处理方法同前所述。按照ROS 测定试剂盒说明书的方法进行操作，将培养完成后的细胞弃上清液后用PBS 清洗1 次，每孔加入100 μL 含10 μmol/L DCFH-DA 探针的无血清培养基，37 ℃避光孵育40 min。用PBS 清洗2次以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，洗净后重悬细胞，于激发光波长为488 nm，发射光波长为525 nm 处测定荧光强度。分别设定正常组（不加BAPs、不经H2O2 处理）、样品组（加BAPs、经H2O2 处理）、模型组（不加BAPs、只经H2O2 处理），设定正常组荧光强度为100%，计算其他各组的相对荧光强度。
MDA 含量、SOD、CAT 活力测定：将浓度为1×105 个/mL 的细胞接种于6 孔板中，每孔2 mL，经药物处理的细胞弃上清后用超声波细胞破碎仪破碎细胞[37]，超声波功率为300 W，每3～5 s 超声一次，间隔3 次，细胞裂解液根据BCA 蛋白定量测定试剂盒说明书加入各试剂后于562 nm 处测定吸光值，计算细胞裂解液中的蛋白浓度，根据MDA、SOD、CAT 试剂盒说明书分别测定各指标。
1.4 数据处理
所有试验结果均用3 次重复试验平均值±标准差表示，采用软件IBM SPSS Statistics 25 进行数据统计学分析，软件Origin 2018 绘图，采用ANOVA 和LSD 多重比较法进行方差和显著性分析，P<0.05 为数据差异显著；P<0.01 为数据差异极显著。
2 结果与分析
2.1 葡聚糖凝胶分离
粗荞麦多肽经Sephadex-G25 分离后于280 nm 处检测到3 个吸收峰，依次命名为S1、S2、S3。收集各组分，减压浓缩后冷冻干燥，保存备用。
2.2 葡聚糖凝胶粗提物的体外抗氧化活性测定
2.2.1 自由基清除作用 以自由基的清除能力为指标，对粗荞麦多肽和Sephadex-G25 分离得到的3 个组分S1、S2、S3 的抗氧化能力进行评价，在对DPPH·清除能力的测定结果中可以看出各组分均具有不同程度的自由基清除能力，且都呈现出剂量依赖，粗组分、S1、S2 和S3 的IC50 分别为（2.98±0.16），（9.45±0.17），（1.06±0.04），（2.29±0.25）mg/mL，S2 的DPPH·清除能力显著高于其它组分，VCEAC 为（4.23±0.13）μg/mg。在对ABTS+·自由基清除测试中，粗组分、组分S2 和S3 对ABTS+·具有明显清除作用，随浓度增加呈现梯度上升的趋势，而S1 抗氧化效果极不明显，即使在质量浓度为5 mg/mL 时对ABTS+·清除率也仅为（9.29±0.70）%仍低于10%，认为几乎没有清除能力，其余三组分的IC50 依次分别为（5.06±0.01），（0.85±0.13），（2.73±0.11）mg/mL，其中S2 表现出极强的活性，ABTS+·清除能力以VCEAC 表示为（45.24±5.81）μg/mg。不同组分在对ABTS+·的清除效果上与DPPH·表现一致，为S2＞S3＞粗组分＞S1。然而，由上述试验结果可以看出，ABTS 检测法与DPPH 检测法评价同一抗氧化剂的抗氧化能力时具有一定差异，这一现象与诸多文献[38-39]中的试验结果一致，这是由于不同测定方法的原理和机理不同[40]，单一的抗氧化分析模型很难较为全面分析抗氧化剂的活性。在对各类物质的VCEAC 测定过程中，果蔬被公认为具有较强的抗氧化活性，本试验中荞麦发酵粗组分DPPH·的VCEAC 值1.50 mg/g略高于Barroso 等[41]测得金草的VCEAC 值1.49 mg/g，显著高于其测定的橘皮、香蕉等果蔬抗氧化活性，但低于本研究中初步分离得到的组分S2 的抗氧化活性，与Zang 等 [42] 测定的21 种水果对DPPH·的清除能力（VCEAC 最高仅为0.37 mg/g）相比，具有明显抗氧化优势。以·OH 清除率作为抗氧化能力评价指标时，各组分的抗氧化活性较DPPH、ABTS 自由基而言均有所下降，且随浓度增加不同组分间对羟基自由基的清除能力差别逐渐增大，当在质量浓度高于3 mg/mL 时，S2 表现出的抗氧化活性显著高于其它组分，IC50 为（5.64±0.15）mg/mL，VCEAC 表示为（300.65±6.54）μg/mg。活性组分S2 在一定的质量浓度范围内，均与自由基的清除率呈正相关，在该浓度范围下，能较为直观地反应抗氧化剂的VCEAC。
2.2.2 还原力 还原力与抗氧化活性关联密切，通常用于评估抗氧化剂提供电子或氢原子的潜力，是衡量总体抗氧化能力的指标，对荞麦发酵粗组分和Sephadex-G25 分离组分进行还原能力测定，结果表明，在质量浓度为1～5 mg/mL 时，各组分还原能力强弱表现为S2＞S3＞粗组分＞S1，其中S1 组分还原力接近于0，且随着浓度增加不呈现出还原力增大的趋势，其余组分均呈现出剂量依赖，随着浓度的提升，还原能力不断增强，S2 还原能力显著高于其余组分，用VCEAC 表示为（36.57±1.98）μg/mg。
2.3 RP-HPLC 分离纯化
经体外抗氧化试验证实组分S2 为主要活性成分，组分S2 经RP-HPLC 分离后得到液相色谱图如图4a 所示，收集10 个分离程度较好的分离峰，依次命名为F1～F10。选择ABTS+·清除率作为抗氧化活性指标，测定各分离峰的抗氧化活性，其中组分F9 为清除ABTS+·的主要活性组分，该分离峰在液相色谱中保留时间为17.95 min，流动相中乙腈比例相对较高，呈现出具有较高疏水性的特点。对多次收集的活性组分F9 进一步进行纯度鉴定如图4b，纯度达96.25%，可认为分离纯化得到纯的抗氧化多肽BAPs。经测定，BAPs 对DPPH·、ABTS+·、·OH 清除率的IC50 分别为（0.37±0.01），（0.25±0.01），（1.88±0.10）mg/mL，VCEAC 分别为（12.12±0.27），（153.82±5.04），（901.95±39.30）μg/mg，还原力用VCEAC 表示为（109.23±1.18）μg/mg。
2.4 Tricine-SDS-PAGE 电泳分子质量分析
BAPs 由于本身分子质量较小，只能通过标准小分子质量蛋白进行估计，推断其是否落入预测的分子质量范围。BAPs 在Tricine-SDS-PAGE 电泳图谱中显示为单一条带，说明达到电泳级纯，其分子质量约为5.8 ku。
2.5 BAPs 傅里叶红外光谱分析
BAPs 的特征峰符合一般蛋白/肽的特征吸收峰。3 400 cm-1 左右的较宽的吸收峰主要由于O-H和N-H 的伸缩振动。2 900～3 000 cm-1 处的吸收峰是由于-CH2 和-CH3 基团中C-H 的伸缩振动。醛、酮、酸类物质以及酰胺中C=O 的伸缩振动会引起1 600～1 700 cm-1 处的红外吸收峰，酰胺羰基引起的吸收峰往往具有更低的波数段[43]，波数在1 617.73 cm-1 处的吸收峰是蛋白质结构中酰胺一带的特征吸收峰。1 440.49 cm-1 处的吸收峰主要是亚甲基面内弯曲振动产生。
2.6 BAPs 抑制H2O2 致RAW 264.7 细胞氧化损伤试验
2.6.1 BAPs 对RAW 264.7 巨噬细胞活性的影响采用CCK-8 试剂盒测定RAW 264.7 巨噬细胞存活率，当多肽质量浓度在25～400 μg/mL 时，细胞存活率均可达到90%以上，此时可认为药品对细胞不具有毒性，是药品可用于试验的安全剂量[44]。在该浓度范围下，相较于正常组细胞而言无显著性差异（P＞0.05），荞麦多肽不对细胞的活性产生影响。当多肽质量浓度到达800 μg/mL 时，细胞存活率低于90%，与正常组细胞相比，生长受到显著（P＜0.05）抑制，荞麦多肽对细胞产生一定的毒性作用，因此选择50，100，200，400 μg/mL 4 个浓度进行后续试验研究。
2.6.2 不同H2O2 浓度刺激对细胞活力影响 过氧化自由基是活性氧的一种，在机体中容易分解产生羟基自由基或氧自由基，促使氧化防御系统失衡，引发氧化应激，并可直接氧化生物分子导致细胞过氧化损伤[45]，利用H2O2 诱导细胞建立细胞氧化应激模型是用来检测糖类、肽类抗氧化活性的常用方法。过高的H2O2 浓度造成细胞的不可逆损伤，过低浓度时细胞不处于氧化应激状态，因此，确定合适的H2O2 浓度是氧化应激模型建立成功的关键。本试验选用浓度100，200，300，400，500，600 μmol/L 的H2O2 对RAW 264.7 细胞进行损伤诱导，细胞存活率对H2O2 浓度呈现出剂量依赖。H2O2 浓度为500 μmol/L 时，细胞存活率为（51.49±4.37）%，接近于50%，细胞处于氧化应激状态，该浓度建立细胞氧化应激损伤模型的适宜浓度。
2.6.3 BAPs 对H2O2 诱导氧化损伤细胞存活率的影响 与正常组细胞相比，经过浓度500 μmol/L的H2O2 刺激后，细胞活力下降至50%左右，BAPs药物处理对H2O2 损伤细胞具有一定的保护作用，与模型组相比，BAPs 质量浓度在200 μg/mL 时，细胞活力显著（P＜0.05）增加，随着浓度提高，细胞活力进一步恢复，BAPs 具有提升RAW 264.7 巨噬细胞抵抗氧化应激的能力。
2.6.4 BAPs 对H2O2 诱导氧化损伤细胞ROS 水平、SOD 及CAT 活力、MDA 含量的影响 以ROS水平、SOD、CAT 活力及MDA 含量为评价指标，探究荞麦多肽对氧化损伤细胞的保护作用。ROS 水平用于反应细胞氧化应激的程度，酶类物质SOD和CAT 用于清除细胞中的自由基，防止细胞损伤，具有细胞保护作用，MDA 为脂质氧化的副产物，用于反应细胞氧化损伤的程度[46]。由图10a 可知，H2O2 能显著引起正常RAW 264.7 巨噬细胞中活性氧含量的增加，模型组较正常组而言，相对荧光强度增加了（60.91±7.44）%，经质量浓度为100 μg/mL 的药物BAPs 处理后，ROS 水平能极显著（P＜0.01）降低26.50%；当质量浓度到达400 μg/mL 时，ROS 水平相对于损伤模型组极显著（P＜0.01）降低了48.22%，由此看出，BAPs 能够减少由外源性H2O2 引起的RAW 264.7 细胞ROS 异常增多的现象。由上述试验现象推测，BAPs 的抗氧化活性可能与多肽中肽类物质的氨基酸序列有关，赵翊君[47]从鲈鱼鱼肉中分离出特定氨基酸序列的肽段，能有效保护H2O2 诱导氧化损伤的HepG2细胞，使细胞中ROS 含量较模型组降低51.21%，且增强了细胞中抗氧化酶的活力。由图10b、10c可知，H2O2 损伤细胞中SOD 和CAT 活力较正常组细胞分别减少了36.74 U/mg prot 和36.44 U/mg prot；与模型组相比，最低质量浓度为100 μg/mL的BAPs 溶液能显著（P＜0.05）提高细胞中SOD 活力13.57 U/mg prot；当质量浓度达到200 μg/mL时，可以极显著提高（P＜0.01）SOD 活力23.48 U/mg prot 和CAT 活力15.71 U/mg prot，且酶活力与多肽浓度呈现出一定的量效关系，说明BAPs具有提高细胞中抗氧化酶活性以对抗氧化应激的能力。高含量的MDA 是细胞发生严重氧化损伤的标志，在正常细胞中，MDA 含量极低，仅为（5.88±2.26）nmol/mg prot，经H2O2 处理后模型组中细胞的MDA 浓度达到（29.66±3.39）nmol/mg prot，随着药物浓度增加，MDA 含量表现出梯度减少的趋势，用质量浓度100 μg/mL 的BAPs 作用后，细胞内MDA 含量较模型组极显著（P＜0.01）降低了6.39 nmol/mg prot，当药物浓度持续增加至最大浓度400μg/mL 后，较模型组降低了47.96%，由以上试验结果表明，BAPs 对RAW 264.7 细胞的氧化损伤具有保护作用。
图1 Sephadex-G25 层析分离图谱
Fig. 1 Sephadex-G25 chromatogram
图2 各组分对自由基的清除能力
Fig. 2 Free radical scavenging ability of each component
注：a，c，e 为不同组分对DPPH·、ABTS+·、·OH 的清除能力；b，d，f 为一定浓度范围下组 分S2 和VC 对DPPH·、ABTS+·、·OH 清除率的线性关系。
图3 各组分的还原能力
Fig. 3 The reduction ability of each component
图4 组分S2 的高效液相色谱图（a）、荞麦多肽的纯度分析图（b）和各分离组分对ABTS 自由基清除率（c）
Fig. 4 High performance liquid chromatography of component S2（a），purity analysis of buckwheat peptides figure（b）and ABTS free radical clearance rate of each separated component（c）
注：字母不同表示具有显著性差异（P＜0.05）。
图5 BAPs 的Tricine-SDS-PAGE 电泳图谱
Fig. 5 Tricine-SDS-PAGE electrophoregram of BAPs
注：M 为标准蛋白；D 为BAPs。
图6 BAPs 的傅里叶红外光谱图
Fig. 6 Fourier transform infrared spectrum of BAPs
图7 BAPs 对正常RAW 264.7 细胞活力影响
Fig. 7 Effect of BAPs on normal RAW 264.7 cell viability
注：# 表示与正常组相比具有显著性差异（P＜0.05）。
图8 不同浓度H2O2 对RAW 264.7 细胞存活率影响
Fig. 8 Effects of different concentrations of H2O2 on the survival rate of RAW 264.7 cells
图9 BAPs 对H2O2 诱导氧化损伤细胞存活率的影响
Fig. 9 Effect of BAPs on the survival rate of H2O2-induced oxidative damage cells
注：## 表示与正常组相比差异极显著（P＜0.01）；* 表示与模型组相比差异显著（P＜0.05）；** 表示与模型组相比差异极显著（P＜0.01）；下同。
图10 BAPs 对氧化损伤细胞抗氧化能力的影响
Fig. 10 Effect of BAPs on the antioxidant capacity of oxidative damaged cells
3 结论
本研究以化学抗氧化为指标，通过Sephadex G-25 凝胶柱分离层析结合RP-HPLC 色谱分离的方法逐步从荞麦益生菌发酵水解液中分离出BAPs，并对其结构进行表征，在此基础上进一步探究BAPs 抵抗H2O2 诱导RAW 264.7 巨噬细胞氧化应激损伤作用的能力。结果表明，BAPs 具有较强的自由基清除能力和还原能力，在细胞抗氧化实验中能有效降低氧化损伤细胞的ROS 水平和脂质过氧化副产物MDA 的含量，减少细胞氧化应激反应的发生，有效阻止细胞的凋亡，增加细胞在氧化损伤发生时的细胞存活率，这一结果与BAPs 能显著提高细胞中抗氧化活性酶类SOD 和CAT 的活性有关。本试验基于分离纯化的方法制备得到BAPs，并在细胞水平进行试验探索其抗氧化能力，然而，对于多肽分子结构及其对细胞的调控机制和动物体内有关活性作用等领域还需要进行进一步研究探索。
[1] VALKO M，LEIBFRITZ D，MONCOL J，et al.Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease[J].The International Journal of Biochemistry &Cell Biology，2007，39（1）：44-84.
[2] LUO X Y，FEI Y，XU Q Z，et al.Isolation and identification of antioxidant peptides from tartary buckwheat albumin（Fagopyrum tataricum Gaertn.）and their antioxidant activities[J].Journal of Food Science，2020，85（3）：611-617.
[3] WU Y Q，REECE A，ZHONG J X，et al.Type 2 diabetes mellitus induces congenital heart defects in murine embryos by increasing oxidative stress，endoplasmic reticulum stress，and apoptosis[J].American Journal of Obstetrics and Gynecology，2016，215（3）：366.e1-e10.
[4] NEHA K，HAIDER R M，PATHAK A，et al.Medicinal prospects of antioxidants：A review [J].European Journal of Medicinal Chemistry，2019，178：687-704.
[5] ALKADI，HOURIEH.A review on free radicals and antioxidants[J].Infectious Disorders Drug Targets，2018，20（1）：16-26.
[6] GORZYNIK -DEBICKA M，PRZYCHODZEN P，CAPPELLO F，et al.Potential health benefits of olive oil and plant polyphenols[J].International Journal of Molecular Sciences，2018，19（3）：547.
[7] AGRAWAL H，JOSHI R，GUPTA M.Purification，identification and characterization of two novel antioxidant peptides from finger millet（Eleusine coracana）protein hydrolysate[J].Food Research Internationale，2019，120：697-707.
[8] SAIDI S，SAOUDI M，BEN AMAR R.Valorisation of tuna processing waste biomass：Isolation，purification and characterisation of four novel antioxidant peptides from tuna by-product hydrolysate[J].Environmental Science and Pollution Research，2018，25（18）：17383-17392.
[9] ROZI P，ABUDUWAILI A，MA S J，et al.Isolations，characterizations and bioactivities of polysaccharides from the seeds of three species glycyrrhiza[J].International Journal of Biological Macromolecules，2020，145：364-371.
[10] 张强，李伟华.抗氧化肽的研究现状[J].食品与发酵工业，2021，47（2）：298-304.ZHANG Q，LI W H.Research progress of antioxidant peptides[J].Food and Fermentation Industries，2021，47（2）：298-304.
[11] YU Y P，LAI S J，CHANG C R，et al.Peptidomic analysis of low molecular weight antioxidative peptides prepared by lotus（Nelumbo nucifera Gaertn.）seed protein hydrolysates [J].LWT -Food Science and Technology，2021，144：111138.
[12] GUO J B，LU A C，SUN Y N，et al.Purification and identification of antioxidant and angiotensin converting enzyme-inhibitory peptides from Guangdong glutinous rice wine[J].LWT-Food Science and Technology，2022，169：113953.
[13] KARAMI Z，PEIGHAMBARDOUST S H，HESARI J，et al.Antioxidant，anticancer and ACE-inhibitory activities of bioactive peptides from wheat germ protein hydrolysates[J].Food Bioscience，2019，32：100450.
[14] JIN D X，LIU X L，ZHENG X Q，et al.Preparation of antioxidative corn protein hydrolysates，purification and evaluation of three novel corn antioxidant peptides[J].Food Chemistry，2016，204：427-436.
[15] GIMENEZ-BASTIDA J A，ZIELINSKI H.Buckwheat as a functional food and its effects on health[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2015，63（36）：7896-7913.
[16] ZIELINSKI H，SZAWARA-NOWAK D，BACZEK N，et al.Effect of liquid-state fermentation on the antioxidant and functional properties of raw and roasted buckwheat flours[J].Food Chemistry，2019，271：291-297.
[17] GABR A M M，SYTAR O，GHAREEB H，et al.Accumulation of amino acids and flavonoids in hairy root cultures of common buckwheat（Fagopyrum esculentum）[J].Physiology and Molecular Biology of Plants，2019，25（3）：787-797.
[18] ZHU H L，LIU S X，YAO L L，et al.Free and bound phenolics of buckwheat varieties：HPLC characterization，antioxidant activity，and inhibitory potency towards alpha -Glucosidase with molecular docking analysis [J].Antioxidants，2019，8（12）：606.
[19] 刘瑶，王新然，赵悦，等.荞麦皮多糖组成及其抗氧化特性分析[J].食品与发酵工业，2019，45（13）：134-140.LIU Y，WANG X R，ZHAO Y，et al.Composition and antioxidant activity of polysaccharides extracted from buckwheat husk[J].Food and Fermentation Industries，2019，45（13）：134-140.
[20] 陈花，张海悦，王鹏.苦荞蛋白酶解产物的抗氧化活性研究[J].食品研究与开发，2017，38（14）：12-16.CHEN H，ZHANG H Y，WANG P.Antioxidant activity of Fagopyrum tataricum enzymolysis product[J].Food Research and Development，2017，38（14）：12-16.
[21] LUO X Y，FEI Y，XU Q Z，et al.Isolation and identification of antioxidant peptides from tartary buckwheat albumin（Fagopyrum tataricum Gaertn.）and their antioxidant activities[J].Journal of Food Science，2020，85（3）：611-617.
[22] STARZYNSKA-JANISZEWSKA A，STODOLAK B，DULINSKI R，et al.Effect of solid-state fermentation tempe type on antioxidant and nutritional parameters of buckwheat groats as compared with hydrothermal processing[J].Journal of Food Processing and Preservation，2016，40（2）：298-305.
[23] HUANG S Q，MA Y L，SUN D，et al.In vitro DNA damage protection and anti-inflammatory effects of Tartary buckwheats（Fagopyrum tataricum L.Gaertn）fermented by filamentous fungi[J].International Journal of Food Science &Technology，2017，52（9）：2006-2017.
[24] CHEN L，ZHANG Q H，JI Z，et al.Production and fermentation characteristics of angiotensin -I -converting enzyme inhibitory peptides of goat milk fermented by a novel wild Lactobacillus plantarum 69[J].LWT-Food Science and Technology，2018，91：532-540.
[25] JOSHI I，K J，NOORANI K P M，et al.Isolation and characterization of angiotensin I-converting enzyme（ACE-I）inhibition and antioxidant peptide from by-catch shrimp（Oratosquilla woodmasoni）waste[J].Biocatalysis and Agricultural Biotechnology，2020，29：101770.
[26] 戴志远，任明，张燕平.电泳和层析方法对梅鱼蛋白酶解产物的分离分析[J].中国食品学报，2007（4）：101-105.DAI Z Y，REN M，ZHANG Y P.Isolation and analysis of enzymatic hydrolysate from small miscellaneous fish protein by electrophorsis and chromatography[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2007（4）：101-105.
[27] 于冬蕾.高温豆粕水解物糖基化法制备糖肽及其特性研究[D].哈尔滨：东北农业大学，2018：15-16.YU D L.Preparation and characterization research of glycopepides by glycosylation of high -temperature denatured soybean meal hydrolysate [D].Harbin：Northeast Agricultural University，2018：15-16.
[28] AONDONA M M，IKYA J K，UKEYIMA M T，et al.In vitro antioxidant and antihypertensive properties of sesame seed enzymatic protein hydrolysate and ultrafiltration peptide fractions [J].Journal of Food Biochemistry，2021，45（1）：e13587.
[29] KIM D O，LEE K W，LEE H J，et al.Vitamin C equivalent antioxidant capacity（VCEAC）of phenolic phytochemicals[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（13）：3713-3717.
[30] 张立华，孙凤杰，赵文亚，等.石榴皮木醋液的化学成分及抗氧化活性[J].食品科学，2016，37（8）：127-130.ZHANG L H，SUN F J，ZHAO W Y，et al.Chemical constituents and antioxidant activities of wood vinegar from pomegranate husk[J].Food Science，2016，37（8）：127-130.
[31] CHANG O K，SEOL K H，JEONG S G，et al.Casein hydrolysis by Bifidobacterium longum KACC91563 and antioxidant activities of peptides derived therefrom [J].Journal of Dairy Science，2013，96（9）：5544-5555.
[32] 邢珂慧.辅色剂对红枣色素抗氧化活性及抗氧化稳定性的影响[D].银川：宁夏大学，2020：20.XING K H.Effect of copigment on antioxidant activity and antioxidant stability of jujube Pigment[D].Yinchuan：Ningxia University，2020：20.
[33] KIM C H，HWANG B S，HWANG Y，et al.Evaluation of antioxidant and antiinflammatory activity of ethanolic extracts of Polygonum senticosum in lipopolysaccharide-induced RAW 264.7 macrophages[J].Journal of Laboratory Medicine，2022，46（1）：51-59.
[34] 史辛夷，封云倩，李云萍，等.福建观音座莲根茎的抗氧化成分提取工艺优化[J].食品工业科技，2022，43（11）：235-243.SHI X Y，FENG Y Q，LI Y P，et al.Study on extraction optimization of anti-oxidants from roots of Angiopteris fokiensis Hieron[J].Science and Technology of Food Industry，2022，43（11）：235-243.
[35] 王晶波，杨倬，秦文，等.牛肝菌多酚细胞抗氧化活性评价模型研究[J].中国食品学报，2021，21（6）：273-279.WANG J B，YANG Z，QIN W，et al.Studies on evaluation model of cellular antioxidant activity for boletus polyphenols[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2021，21（6）：273-279.
[36] QIN T，REN Z，LIU X P，et al.Study of the selenizing Codonopsis pilosula polysaccharides protects RAW264.7 cells from hydrogen peroxide-induced injury[J].Internationale Journal of Biological Macromolecules，2019，125：534-543.
[37] 李锋，李清仙，程志远，等.坛紫菜多酚抗氧化及抑制UVB 致HSF 细胞氧化损伤作用[J].食品科学，2017，38（17）：190-197.LI F，LI Q X，CHENG Z Y，et al.Antioxidant and protective effect of porphyra haitanensis polyphenols against oxidative damage induced by UVB in HSF cells[J].Food Science，2017，38（17）：190-197.
[38] AVILÉS-GAXIOLA S，LEÓN-FÉLIX J，JIMÉNEZNEVÁREZ Y B，et al.Antioxidant and anti-inflammatory properties of novel peptides from Moringa oleifera Lam.leaves[J].South African Journal of Botany，2021，141：466-473.
[39] BOERI P，PINUEL L，DALZOTTO D，et al.Argentine Patagonia barberry chemical composition and evaluation of its antioxidant capacity[J].Journal of Food Biochemistry，2020，44（7）：e13254.
[40] CHO S J.Changes in the antioxidant properties of rice bran protein isolate upon simulated gastrointestinal digestion[J].LWT-Food Science and Technology，2020，126：109206.
[41] BARROSO R P，BERLIM L S，ITO A S，et al.In vitro antioxidant properties of golden grass（Syngonanthus nitens）by electron paramagnetic resonance[J].Food Science &Nutrition，2019，7（4）：1353-1360.
[42] ZANG S，TIAN S Z，JIANG J，et al.Determination of antioxidant capacity of diverse fruits by electron spin resonance（ESR）and UV-vis spectrometries[J].Food Chemistry，2017，221：1221-1225.
[43] 刘文，张悦容，张腾军，等.牡蛎体液糖蛋白的分离纯化及其理化性质分析[J].中国食品学报，2013，13（11）：179-184.LIU W，ZHANG Y R，ZHANG T J，et al.Isolation，purification and characterization of glycoprotein from Oyster juice[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2013，13（11）：179-184.
[44] HUI X D，WU G，HAN D，et al.The effects of bioactive compounds from blueberry and blackcurrant powder on oat bran pastes：enhancing in vitro antioxidant activity and reducing reactive oxygen species in lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 macrophages[J].Antioxidants（Basel，Switzerland），2021，10（3）：338.
[45] WANG W，ZHANG F M，LI Q，et al.Structure characterization of one polysaccharide from Lepidium meyenii Walp.，and its antioxidant activity and protective effect against H2O2-induced injury RAW264.7 cells [J].Internationale Journal of Biological Macromolecules，2018，118（Pt A）：816-833.
[46] LI Y，LI J，LIN S J，et al.Preparation of antioxidant peptide by microwave-assisted hydrolysis of collagen and its protective effect against H2O2-induced damage of RAW264.7 cells[J].Marine Drugs，2019，17（11）：642.
[47] 赵翊君.鲈鱼鱼肉抗氧化肽的分离鉴定及其对HepG2 细胞氧化损伤的保护作用研究[D].广州：华南理工大学，2018：62-65.ZHAO Y J.Separation and characterization of antioxidant Peptides from bass muscle and their protective effects against oxidative damage in HepG2 cells[D].Guangzhou：South China University of Technology，2018：62-65.