近年来,疏水生物活性物质递送系统的开发,引起了越来越多研究者的关注[1]。其中具有代表性的是疏水生物活性物质模型——姜黄素,是一种存在于植物根茎中的天然多酚类化合物,在抗炎[2]、抗氧化[3]、抗血脂[4]、抗肿瘤[5]等方面具有良好的医学价值。然而,由于姜黄素中存在活性亚甲基和β-二酮[6],使其溶解性、稳定性和生物利用度较差[7],这限制了姜黄素在食品和医药中的应用[8]。提高姜黄素在水中的溶解性、稳定性以及生物利用度,是姜黄素在食品和医药领域应用中亟待解决的问题。迄今为止,研究人员提出许多方法来克服这一限制,其中在纳米颗粒递送系统中封装姜黄素是克服这些缺点的有效方法[9]。例如:用蛋清蛋白[10]、小麦麦胶蛋白[11]、玉米醇溶蛋白[12]等封装姜黄素,由于蛋白质基材料的无毒、生物相容性、固有的生物降解性和较高的营养价值,因此被认为是潜在的递送载体[12]。
与其它植物蛋白相比,大豆蛋白具有较高的营养价值,富含相对均衡的必需氨基酸[13],是一种有吸引力的食品材料和食品添加剂[14]。大豆分离蛋白(SPI)是纯度最高的大豆蛋白产品,主要由7S(β-conglycinin)和11S(glycinin)两个球状蛋白组成[15]。在水环境中,这些组分主要是由亲水壳和疏水核组成的球状分子和一定量的水溶性聚集体组成[16]。研究表明,在极端pH 条件下,SPI 的球形蛋白结构部分展开,产生更好的肽链灵活性,然而,在中性pH 值下蛋白质部分再变性,形成“熔球”结构[17]。此外,pH 驱动是一种低能量、无溶剂的自组装方法,可用于姜黄素的各种载体封装[18-19],该方法是利用姜黄素在水介质中的pH 依赖性溶解度[20]。鉴于上述SPI 在不同pH 值下的特性,以及pH 驱动自组装方法的高效性,本研究使用pH 驱动大豆蛋白自组装来封装姜黄素。
目前,关于制备SPI-Cur 纳米复合物时影响装载率的因素鲜有研究报道。本研究以影响SPICur 纳米颗粒装载率的3 大因素(蛋白浓度、姜黄素添加浓度、pH 驱动组合)设计单因素实验,以得到3 组最合适的蛋白浓度、姜黄素添加浓度、pH驱动组合。采用响应面试验优化SPI-Cur 纳米颗粒的制备工艺。对SPI-Cur 纳米颗粒粒径、ζ 电位、PDI 分散性指数、外观形貌进行表征。对其热稳定性和胃肠道模拟消化稳定性进行评价。
大豆分离蛋白粉(SPI,≥86%蛋白,灰分约为4.00%),烟台东方蛋白科技有限公司;姜黄素(Cur,≥98%),萨恩化学技术有限公司(上海,中国);胃蛋白酶(≥250 units/mg),美 国Sigma 公司;胰蛋白酶(≥250 NFU/mg),美国Solarbio 公司;所有其它化学品和溶剂均为分析纯级。
SPS202F 分析天平,瑞士梅特勒-托利多公司;FE20K 型pH 计,瑞士梅特勒-托利多公司;UV-1780 紫外-可见分光光度计,日本SHIMADZU 公 司;NanoZS Zetasizer ZS90 激光粒度仪,英国Malvern Instruments 公司;SU8020 扫描电子显微镜,日本Hitachi 公司;Tensor 27 傅里叶红外光谱仪、AXS D8 Advance X 射线衍射仪,德国BRUKER;3K15 冷冻离心机,德国Sigma 公司;HH-4 数显恒温水浴锅,普瑞斯机械有限公司。
1.2.1 大豆蛋白姜黄素纳米复合物的制备单因素实验 大豆蛋白纳米复合物的制备采用pH 驱动法制备,参照Zhang 等[21]大豆蛋白纳米复合物的制备方法稍有修改,将制备完成的大豆蛋白-姜黄素纳米复合物视为SPI-Cur。SPI-Cur 纳米复合物的制备单因素实验分别考察大豆分离蛋白浓度、姜黄素添加浓度、pH 驱动组合对姜黄素装载率的影响。
1)分别配制质量浓度为40,45,50,55,60 mg/mL 的大豆分离蛋白溶液,使用1 mol/L NaOH调节大豆分离蛋白溶液的pH 值至12.0,经600 r/min 磁力搅拌1 h 后,添加0.2 mg/mL 姜黄素,避光搅拌30 min 使其完全混合后,使用1 mo/L HCl 立即回调溶液pH 值至7.0,避光磁力搅拌1 h 后,将大豆蛋白姜黄素溶液在20 ℃,8 000 r/min 离心15 min,取上清液透析过夜并储存在冰箱中(4 ℃)。
2)配制质量浓度为50 mg/mL 的大豆分离蛋白溶液,1 mol/L NaOH 将其pH 值调至12.0,经600 r/min 磁力搅拌1 h 平衡后,添加0.1,0.2,0.4,0.6,0.8 mg/mL 姜黄素,避光搅拌30 min 使其完全混合后,1 mol/L HCl 立即调回溶液pH 值为7.0,避光磁力搅拌1 h 后,将大豆蛋白姜黄素溶液在20 ℃,8 000 r/min 离心15 min,取上清液透析过夜并储存在冰箱中(4 ℃)。
3)配制质量浓度为50 mg/mL 的大豆分离蛋白溶液,1 mol/L NaOH 将其pH 值调至9.0,10.0,11.0,12.0,13.0,经600 r/min 磁力搅拌1 h 平衡后,添加0.1 mg/mL 姜黄素,避光搅拌30 min 使其完全混合后,1 mo/L HCL 立即调回溶液pH 值为3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,避光磁力搅拌1 h 后,将大豆蛋白姜黄素溶液在20 ℃,8 000 r/min 离心15 min,取上清液透析过夜并储存在冰箱中(4 ℃)。
1.2.2 姜黄素的装载效率(LE)测定 对姜黄素的装载效率(LE)的评估参照Zhang 等[21]的方法并稍有修改。使用无水乙醇从SPI-Cur 纳米复合物中获得负载的姜黄素,将0.2 mL 负载姜黄素的SPICur 复合物与1.8 mL 无水乙醇混合并剧烈摇动,将混合物在10 000×g、25 ℃下离心15 min,然后使用紫外-可见分光光度计在426 nm 处测定。使用溶解在无水乙醇中的游离姜黄素(0~10 μg/mL)绘制的标准曲线y=0.0904x+0.004(R2=0.9973)来计算姜黄素的负载浓度。使用以下公式(1)计算LE:
1.2.3 响应面优化试验设计 在单因素实验的基础上,选取蛋白浓度(A)、姜黄素添加浓度(B)、pH驱动组合(C)为考察因素,其中考察因素C 中的1 为将大豆蛋白溶液调至pH 12.0,添加姜黄素后调回pH 7.0;考察因素C 中的2 为将大豆蛋白溶液调至pH 13.0,添加姜黄素后调回pH 7.0;考察因素C 中的3 为将大豆蛋白溶液调至pH 13.0,添加姜黄素后调回pH 8.0。采用Box-Behnken 设计对大豆蛋白-姜黄素纳米颗粒的制备工艺进行优化。试验因素及编码见表1。
表1 试验因素水平及编码
Table 1 Test factor levels and codes
1.2.4 结构表征
1.2.4.1 粒子大小、PDI 分散性指数、ζ 势测定 大豆蛋白-姜黄素纳米颗粒的平均粒径、PDI 分散性指数和ξ-电势的测定参考Liu 等[22]的方法稍有修改。将SPI、SPI-Cur 稀释到适当浓度后,使用激光粒度仪测定它们的平均粒径、PDI 分散性指数和ξ电位,所有测量均在室温下进行,并重复3 次。
1.2.4.2 形貌特征观察 大豆蛋白-姜黄素纳米颗粒的微观形貌观察参考Yuan 等[23]的方法稍有修改。使用扫描电子显微镜观察SPI、SPI-Cur 纳米复合物的形态特征,采用喷金制样,将样品粉末进行喷金操作,使其被一层金属覆盖,然后在3 kV 下观察样品的微观结构。
1.2.4.3 傅里叶红外光谱 傅里叶红外光谱表征参照Yuan 等[23]的方法稍有修改。用傅里叶红外光谱仪测定Cur、SPI、SPI-Cur 以及SPI 与Cur 的物理混合物(SPI 与Cur 的质量比为50∶1)的红外光谱。红外光谱的波数为400~4 000 cm-1,分辨率为2 cm-1。
1.2.4.4 XRD X 射线衍射图谱表征参照Zhang等[24]的方法稍有修改。为了研究样品的分子排列,使用X 射线衍射仪测量了Cur、SPI、SPI-Cur 以及SPI 与Cur 的物理混合物(SPI 与Cur 的质量比为50∶1)的XRD 图谱,设定扫描角度为3°~60°(2θ),扫描速率为4°/min。
1.2.5 大豆蛋白-姜黄素纳米颗粒的稳定性评价
1.2.5.1 热稳定性 大豆蛋白-姜黄素纳米颗粒的热稳定性评价参照Yuan 等[23]的方法稍有修改。取2 mL Cur、SPI-Cur 样品置于试管中,放入75,85,95 ℃恒温水浴锅中水浴加热2 h,每30 min 取少量样品,用乙醇萃取后,在426 nm 波长下测量吸光度值,获得姜黄素浓度,并通过公式(2)计算姜黄素在热环境下的保留率,以判断姜黄素的热稳定性。
1.2.5.2 胃肠道模拟消化 大豆蛋白-姜黄素纳米颗粒的胃肠道稳定性评价参考Cheng 等[25]的方法稍有修改。取2.5 g 胃蛋白酶,加入至1 mol/L 的稀盐酸中,并使用稀盐酸定容至250 mL,视为胃模拟消化液。取2.5 g 胰蛋白酶,加入至pH 值为7.4 的PBS 缓冲溶液中,定容至250 mL,视为肠模拟消化液。将Cur、SPI-Cur 各取10 mL 与10 mL胃模拟消化液添加至锥形瓶中并放入搅拌子,在37 ℃水浴锅中加热搅拌1 h 后取出,调pH 值至7.4,用乙醇萃取并在426 nm 波长下检测样品吸光度值。通过公式(3)计算姜黄素在模拟胃液中的保留率,判断其稳定能力。
进入肠道消化模拟试验,各锥形瓶加入40 mL 肠模拟消化液,在37 ℃水浴锅中加热搅拌1 h后取出,取锥形瓶中部分样品加入至离心管中,以10 000 r/min 的转速,离心15 min,以获得上清液。取上清液用乙醇萃取在426 nm 波长下检测样品吸光度值。通过公式(4)计算姜黄素在模拟肠液中的保留率,判断其生物可利用能力。
1.2.6 统计分析 所有测定均进行3 次,使用SPSS20.0 软件进行分析,数值以平均值±标准差表示;使用Design-Expert 13 根据Box-Behnken 设计试验方案制作响应面优化设计;使用Origin 2021 进行相关图表的绘制。
由图1a 可知,在pH 驱动组合为pH 12.0 调至7.0,姜黄素添加量为0.2 mg/mL,大豆蛋白质量浓度为40,50,60 mg/mL 时,制成的纳米颗粒装载率分别为53.32%,70.85%,57.49%,因此在响应面试验中选取这3 个蛋白浓度作为3 个水平进行优化设计。
图1 大豆蛋白浓度(a)和姜黄素添加浓度(b)对姜黄素包埋率的影响
Fig. 1 Effect of soy protein concentration(a)and curcumin addition concentration(b)on curcumin encapsulation rate
注:图中字母(a-e)为不同的样本有显著差异,P 表示差异明显(P<0.05)。
由图1b 可知,在pH 驱动组合为pH 12.0 调至7.0,大豆蛋白质量浓度为50 mg/mL,姜黄素添加质量浓度为0.1,0.2,0.4,0.6,0.8 mg/mL 时,制成的纳米颗粒装载率最优的3 组分别为0.1,0.2,0.4 mg/mL,但综合考虑姜黄素添加质量浓度为0.1 mg/mL 时的姜黄素负载量没有添加质量浓度为0.6 mg/mL 时的效果理想,故在响应面试验中选取0.2,0.4,0.6 mg/mL 作为3 个水平进行优化设计。
由图2 可知,在50 mg/mL 大豆蛋白中分别添加0.1,0.2,0.4,0.6,0.8 mg/mL 姜黄素的各pH 驱动组合下装载率的变化趋势相似,并且得出将pH值由13.0 调回7.0 或8.0 时的装载率较高且稳定,这与Zhang 等[21]制备大豆蛋白时pH 12.0 调回pH 7.0 的pH 组合的装载率相似。因此,在响应面试验中选取pH 12-7,13-7,13-8 作为3 个水平进行优化。
图2 pH 驱动组合对姜黄素包埋率的影响
Fig. 2 Effect of pH-driven combinations on curcumin encapsulation rate
注:在50 mg/mL 大豆蛋白条件下分别添加0.1 mg/mL(a)、0.2 mg/mL(b)、0.4 mg/mL(c)、0.6 mg/mL(d)、0.8 mg/mL(e)姜黄素的各pH 驱动组合。
在前期单因素实验的基础上,以装载率(Y,%)为响应值,利用Box-Behnken 中心组合设计试验模型,拟合二次多项方程可得最优制备方法。3 因素3 水平的响应面试验结果如表2 所示。
表2 Box-Behnken 中心组合设计试验模型
Table 2 Box-Behnken central combined design of experiments model
通过采用Design-Expert 13 软件对Box-Behnken 中心组合设计试验模型数据进行拟合,可得二次多项回归方程:Y=4.39A-1.75B+14.72C-1.72AB -2.86AC -6.71BC -16.66A2 -10.00B2 -14.08C2+85.15。为了更好检验模型的有效性,对响应面模型进行方差和显著性分析,回归模型的方差分析结果如表3 所示。
表3 回归模型的方差分析表
Table 3 Analysis of variance table for the regression model
由表3 方差分析可知,回归模型的F 值为3.92,P 值为0.0425(<0.05),表示该回归模型显著;失拟项F 值为5.05,P 值为0.0759(>0.05),表示失拟项不显著,上述结果说明该模型对真实情况的模拟是准确的,也表明此预测模型可以用于大豆蛋白-姜黄素纳米颗粒制备工艺的优化。此外,该回归模型的回归系数R2=0.8346,表明该模型能解释83.46%响应值变化,拟合度较好。综上,说明可通过该模型预测获得制备大豆蛋白-姜黄素纳米颗粒的最佳工艺。通过表3 中三因素的P值亦可知三因素对姜黄素装载率的影响力:pH 驱动组合>大豆蛋白浓度>姜黄素添加浓度。
图3 是大豆蛋白浓度、姜黄素添加浓度和pH驱动组合三因素之间的交互作用对姜黄素装载率的等高线图和响应面图。由图可知,当蛋白质量浓度为50 mg/mL,姜黄素添加质量浓度为0.4 mg/mL时,响应曲面为最高点,且等高线形状为马鞍状(图3a),表明蛋白浓度和姜黄素添加浓度间的相互作用对制备大豆蛋白-姜黄素纳米颗粒的装载率影响显著;当蛋白质量浓度为50 mg/mL,pH 驱动组合为13.0 调回7.0 时,响应曲面为最高点,且等高线形状为马鞍状(图3b),表明蛋白浓度和pH 驱动组合间的相互影响对制备大豆蛋白-姜黄素纳米颗粒的装载率影响极显著;当姜黄素添加质量浓度为0.4 mg/mL,pH 驱动组合为13.0 调回7.0 时,响应曲面为最高点,且等高线形状为马鞍状(图3c),表明姜黄素添加浓度和pH 驱动组合对制备大豆蛋白-姜黄素纳米颗粒的装载率影响显著。综上所述,通过Design-Expert 13 软件分析,得出了SPI-Cur 纳米复合物的最佳制备工艺为:蛋白质量浓度为50 mg/mL,姜黄素添加质量浓度为0.4 mg/mL,pH 驱动组合为13.0 调回7.0。
图3 大豆蛋白质量浓度、姜黄素添加质量浓度和pH 驱动组合对姜黄素装载率的影响
Fig. 3 Effect of soy protein concentration,curcumin addition concentration and pH-driven combination on curcumin loading rate
2.3.1 粒径、PDI 分散性指数和ζ 电位分析 表4揭示了SPI-Cur 纳米颗粒复合物的平均粒径、PDI和ζ-势。在纳米输送载体领域,严格地将平均粒径为1~1 000 nm 的颗粒定义为纳米粒子[26],输送载体对生物活性物质的输送特性以及对其生物效价的增效作用与载体的尺寸密切相关,当载体的粒径小于500 nm,可显著提高被输送的生物活性物质的生物效价[27]。由表可知,SPI 的平均粒径为(914±34.22)nm,经过pH 驱动处理后,使得颗粒平均粒径显著(P<0.05)减小为(211.7±6.58)nm,这可能是由于静电斥力和空间位阻[28]。这一结果与Pan 等[29]使用pH 驱动制备酪蛋白纳米颗粒的结果一致。
表4 SPI、SPI-Cur 的平均粒径、多分散性指数和ζ 电位
Table 4 Mean particle size,polydispersity index and ζ-potential of SPI,SPI-Cur
注:同一列中字母(a-b)为不同的样本有显著差异;P 表示差异明显(P<0.05)。
PDI 常用于评价样品溶液的平均均匀性,PDI值越大,说明样品溶液中粒径分布范围越大[30]。SPI的PDI 为(0.753±0.43),大于0.7 表示SPI 的粒径分布非常广泛,而SPI-Cur 的PDI 为(0.38±0.06),小于0.4 表明其分散性良好并且粒径分布较窄。ζ电位是纳米粒子表面电荷的指示物,一般来说,分子或分散粒子越小,Zeta 电位的绝对值(正或负)越高,体系越稳定[31],SPI 的ζ 电位为(-33.97±0.25)mV,通过pH 驱动装载Cur 后,SPI-Cur 复合纳米粒子的ζ 电位显著(P<0.05)变为(-38.4±0.4)mV,这一现象证明了Cur 与SPI 蛋白分子相结合。由此可见,粒径较小、PDI 较低、Zeta 电位的绝对值较高的SPI-Cur 纳米复合物具有自稳定性,其增强的电荷可以防止聚集体的形成,提高了其稳定性。
2.3.2 外观形貌分析 用扫描电镜观察了SPI 和SPI-Cur 复合纳米颗粒的表面形貌,如图4 所示,SPI 呈规则的球状形态,结构紧凑,粒子是呈簇状分布,pH 驱动包埋姜黄素后,SPI-Cur 复合纳米颗粒为重叠交错的不规则片状,表面粗糙,这与Yuan 等[23]在通过部分酶解自组装大豆蛋白纳米颗粒进行pH 驱动包封姜黄素研究中的结果相似。与动态光散射(DLS)测量的粒径相比,粒径有减小的趋势,粒径数据的差异可能是冻干和水合样品表现出不同状态的结果,并且DLS 粒径反映了颗粒的平均直径,扫描电镜反映了局部粒径[32]。
图4 SPI、SPI-Cur 的扫描电镜
Fig. 4 Scanning electron microscopy of SPI,SPI-Cur
注:a、b 为SPI 在1.00 μm 和500 nm 下的形貌;c、d 为SPI-Cur在1.00 μm 和500 nm 下的形貌。
2.3.3 FTIR 分析 姜黄素、SPI 和SPI-Cur 纳米复合物的FTIR 光谱如图5 所示,游离Cur 在3 500.63,1 610.48,1 502.47,1 271.02,1 163.01,1 026.08,960.50 cm-1 处表现出几个特征峰,但被包封到SPI 后,姜黄素大部分的特征吸收峰消失了,这是因为姜黄素分子的拉伸振动受到限制,这表明姜黄素被包裹进了SPI[33]。然而,SPI 和Cur 的物理混合物SPI-Cur-Mix(SPI ∶Cur=50 ∶1)的光谱中,姜黄素的部分特征峰仍然被检测到,这些现象证明姜黄素被成功地负载到了SPI 纳米复合物中。这一结果与姜黄素负载的玉米醇溶蛋白[7]、卵清蛋白[34]等研究结果一致。
图5 Cur、SPI、SPI-Cur 和SPI-Cur-Mix 的傅里叶红外光谱
Fig. 5 FTIR spectra of Cur,SPI,SPI-Cur and SPI-Cur-Mix
注:SPI-Cur-Mix 为大豆分离蛋白与姜黄素质量比为50∶1的物理混合物。
2.3.4 XRD 分析 通过XRD 分析姜黄素和SPICur 纳米颗粒的物理状态(图6),游离姜黄素高度结晶,在28.97°,27.34°,26.60°,25.61°,24.61°,23.20°,21.07°,19.38°,18.81°,17.10°,15.85°,14.45°,12.19°,8.81°等衍射角处有明显的特征吸收峰,这与Dai 等[35]的研究结果相似。物理混合物SPI-Cur-Mix 的XRD 图谱中,在17.20°,8.85°衍射角处观察到了姜黄素的特征吸收峰,相比之下,在SPI-Cur 纳米复合物颗粒中,姜黄素结晶形式的特征峰消失了,这表明姜黄素以非晶态形式被捕获在大豆分离蛋白基质中,Pujara 等[36]也报道了类似的结果。
图6 Cur、SPI、SPI-Cur 和SPI-Cur-Mix 的XRD 谱
Fig. 6 XRD spectra of Cur,SPI,SPI-Cur and SPI-Cur-Mix
注:SPI-Cur-Mix 为大豆分离蛋白与姜黄素质量比为50∶1的物理混合物。
2.4.1 热稳定性 在中性pH 下,热处理会加速姜黄素的降解,极大地限制了姜黄素在加工过程中的应用。图7 结果显示,75,85,95 ℃孵育30 min 后,游离姜黄素的保留率分别显著(P<0.05)降低至61.2%,49.15%,47.45%,pH 驱动封装后,姜黄素的热稳定性显著(P<0.05)提高,保留率分别为92.8%,68.7%,65.87%;孵育120 min 后,3 种温度下游离姜黄素的保留率仅为43.12%,13.38%,13.78%,而封装后,姜黄素的保留率分别为63.64%,27.41%,24.37%,不同温度下姜黄素的保留率分别比游离姜黄素提高了1.48,2.05 和1.77 倍,这表明了SPI 对姜黄素具有较好的保护效果。
图7 游离姜黄素和包封姜黄素热稳定性
Fig. 7 Thermal stability of free and encapsulated curcumin
2.4.2 胃肠道模拟消化稳定性 在模拟胃和肠道条件下测定游离和包埋姜黄素的保留率(图8),游离姜黄素经过胃液消化后保留率为78.56%,再经肠液消化后保留率显著(P<0.05)下降至63.38%,经过pH 驱动包埋后的姜黄素经过胃液消化后保留率为94.27%,再经肠液消化后保留率仍保持为86.5%,显著(P<0.05)高于游离姜黄素经胃肠道模拟消化后的保留率,这可能与SPI 的抗消化特性密切相关,SPI-Cur 能够很好地保护疏水核心的姜黄素不被消化酶释放或降解。Zhang 等[37]也得到了类似的结果,包封后的姜黄素稳定性提高,降解率低于10%。因此,可以得出大豆分离蛋白纳米复合物可显著提高姜黄素在模拟消化液中的稳定性和生物可利用率。
图8 游离姜黄素和包封姜黄素体外模拟胃肠消化的稳定性
Fig. 8 Stability of free and encapsulated curcumin in simulating gastrointestinal digestion in vitro
注:图中字母(a-d)为不同的样本有显著差异;P 表示差异明显(P<0.05)。
本研究以装载率为评价指标,分别对影响大豆分离蛋白-姜黄素纳米颗粒装载率的3 大因素(蛋白浓度、姜黄素添加浓度、pH 驱动组合)进行单因素实验分析和响应面条件优化,最终确定了SPI-Cur 纳米复合物的最佳制备工艺是:蛋白质量浓度为50 mg/mL,姜黄素添加质量浓度为0.4 mg/mL,pH 驱动组合为13.0 调回7.0。最优工艺得到的SPI-Cur 纳米颗粒的平均粒径为(211.7±6.58)nm,其分散性良好、粒径分布较窄并且具有较好的稳定性,SEM、FTIR 和XRD 结果显示姜黄素被成功地负载到了SPI 纳米复合物中,并且是以非晶态形式被捕获在大豆分离蛋白基质中。此外,SPI 的保护使姜黄素具有更好的热稳定性和胃肠道生物可及性。上述结果为SPI-Cur 纳米颗粒的制备提供了技术依据、科学的理论支撑,也为深入探索蛋白基输送载体在装载和递送生物活性化合物方面奠定了理论基础。
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Process Optimisation,Structural Characterisation and Stability Analysis of Soybean Isolate Protein-curcumin Nanoparticle Preparation
刘文颖 E-mail:wenyingliu888@126.com
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