作为世界上最古老的发酵酒之一，黄酒在中华文明以及中国人日常生活中占据重要地位。作为中国黄酒的典型代表之一，红曲酒主要以糯米为原料，以红曲为糖化发酵剂，经红曲菌、酵母菌等多种微生物共同发酵酿造而成[1]。目前，红曲酒通常在开放式的环境下生产，其酿造过程中复杂的微生物群落演替和代谢活动赋予了其独特的风味品质。众所周知，红曲菌的次级代谢产物（如：莫纳克林K、红曲黄素和红曲素等）因具有减轻肝损伤程度[2]，降低血脂水平[3]等潜在健康功效而备受关注[4]。由红曲酿造的红曲酒具有良好的发展前景，有可能成为国内外备受青睐的健康酒[1，5]。
生物胺是一类含氨基的低分子质量有机化合物，广泛存在于传统发酵食品中，主要包括腐胺、尸胺、酪胺、苯乙胺、组胺、色胺、精胺和亚精胺等。据报道，外源生物胺过量摄入可引起头痛、呕吐和腹泻等症状，对人体健康造成严重危害[6]。其中，酪胺被认为是毒性最强的生物胺，其引起的“奶酪反应” 会导致交感神经系统和肾上腺髓质产生的儿茶酚胺扩散，促进心率升高而导致高血压[7]。亚精胺和精胺则因存在于高生长率的组织中[8]，并可能与亚硝酸盐反应形成致癌的亚硝胺而加速癌症恶化[9]。值得注意的是，酒精类饮料中的乙醇会进一步抑制与生物胺分解相关的胺类氧化酶的活性，因此应更加重视控制酒类饮品中生物胺的含量[10]。在开放环境下，复杂多样的酿造微生物体系会导致黄酒中生物胺的累积，严重阻碍黄酒产业的发展。据报道，黄酒的发酵醪液中的肠球菌属、肠杆菌属、乳酸杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、链球菌属和假单胞菌属等菌属是促进生物胺产生的主要微生物[11-12]。同时，Zhang 等[13]研究进一步证实了肠杆菌科是黄酒中生物胺形成的重要原因。
为有效抑制黄酒生产中生物胺的生成，目前通常采用控制游离氨基酸含量，优化贮存条件，促进生物胺降解，以及功能微生物强化等方法。有研究尝试通过控制氨基酸的含量来抑制常见生物胺的生成[14]，然而，氨基酸对黄酒风味和营养价值具有重要贡献，降低氨基酸含量可能降低黄酒的风味品质和营养价值。利用胺氧化酶来减少黄酒酿造中生物胺的累积可行性较差，因为黄酒中的乙醇对分解生物胺相关的胺氧化酶具有明显的抑制作用[10]。近年来，随着黄酒酿造微生物组研究的不断深入，有学者提出采用功能微生物强化发酵的方式，对黄酒酿造过程中生物胺的生成进行消减调控[15]。例如：Liu 等[16]基于高通量测序技术对黄酒酿造微生物菌群进行筛选，获得不产生物胺的植物乳杆菌JN01，将其接种于麦曲黄酒的酿造体系进行强化发酵，使麦曲黄酒中生物胺浓度显著降低（消减率达24%）。然而，利用乳酸菌进行生物强化易导致黄酒酸败，同时会抑制酵母菌的生长代谢，进而影响黄酒的风味品质[17]。
作为黄酒酿造中的主要功能微生物，酵母菌是酒中醇类和酯类等特征风味组分产生的积极贡献者。有研究表明，酵母菌对生物胺生成的贡献作用较低，甚至不会产生生物胺[18]。关于酵母菌强化发酵对红曲酒酿造过程生物胺及风味品质的影响，至今未见相关的研究报道。本文通过外源添加酿酒酵母对红曲酒酿造进行强化发酵，探究其对红曲酒酿造过程生物胺和挥发性风味组分的影响，以及对酿造微生物菌群组成的调控作用，旨在建立基于酵母菌强化发酵的调控技术，降低红曲酒生物胺含量，提升红曲酒的风味品质，为改进红曲酒酿造工艺提供参考，促进我国黄酒酿造产业的健康可持续发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酿造红曲（酒曲），福建屏湖红生物科技有限公司；酿酒所用糯米（东北产），福建省辉业食品集团有限公司；组胺盐酸盐（纯度＞99%）、腐胺盐酸盐（纯度＞98%）、尸胺盐酸盐（纯度＞98%）、苯乙胺盐酸盐（纯度＞98%）、酪胺盐酸盐（纯度＞98%）、色胺盐酸盐（纯度＞98%）、亚精胺盐酸盐（纯度＞98%）、精胺盐酸盐（纯度＞98%）等生物胺标准品，美国西格玛奥德里奇公司（Sigma-Aldrich 公司）；色谱级2-辛醇（98.0%），德国Dr.Ehrensorfer 公司；其余化学试剂均为国产分析纯级，国药集团化学试剂有限公司；MGIEasy 微生物DNA 提取试剂盒，深圳华大智造科技股份有限公司。本文基于课题组前期筛选的1 株低产生物胺的酿酒酵母D3（Saccharomyces cerevisiae D3，Sc），对红曲酒传统酿造进行强化发酵，探究强化发酵对红曲酒酿造微生物组成及风味品质形成的调控作用。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱仪（Agilent 1100 系列）、气相色谱-质谱联用仪（7890B/5977A），美国安捷伦科技有限公司；固相微萃取手柄（57330-U）、固相微萃取纤维头（50 μm DVB/ CAR/ PDMS），美国Supelco 公司；Illumina HiSeq 2500 仪器，美国Illumina 公司。
1.3 方法
1.3.1 酵母菌的活化培养 酵母菌活化：从超低温保存箱中取出甘油管中保存的酿酒酵母D3 菌种，取100 μL 菌液接种于100 mL 的YPD 液体培养基中，于28 ℃恒温培养箱中活化培养48 h。
酵母菌扩培：将活化培养的菌液吸取1 mL 接种至50 mL 的YPD 液体培养基中，于30 ℃恒温振荡培养箱（200 r/min）振荡培养24 h，在4 ℃下离心（10 000×g）获得菌体沉淀，经无菌生理盐水重悬获得菌悬液，根据平板稀释涂布的结果计算菌悬液中酵母菌的活菌数（CFU/mL）。
1.3.2 基于酵母菌强化发酵的红曲酒酿造工艺红曲酒酿造工艺流程如图1 所示，主要操作步骤如下：将糯米称重、洗净后，隔夜浸泡，用蒸笼将糯米蒸熟（时间约40 min），摊凉至室温后称重，计算吸水率，以1 L 酒坛加入300 g 生糯米计算，将红曲和熟糯米混匀后放入酒坛中（曲∶米∶水=1∶10∶15，V/V/V），加入酵母菌菌液（终浓度1×105 CFU/mL）并搅匀，用透气的封口膜封口，置于18 ℃的恒温培养箱中进行糖化发酵，在发酵第10 天后，将透气的封口膜换成塑料膜，进行密封无氧发酵。本研究设置空白对照组和试验组（酿酒酵母强化组），每个试验组均设置3 个平行，分别在酿造过程的第1，3，5，7，10，15，20，30 天，将酒坛内酒醪样搅拌均匀后取样，样本迅速放于-80 ℃冰箱，待后续检测分析。
图1 基于酿酒酵母强化发酵的红曲酒酿造工艺流程
Fig.1 Brewing process of Hongqu rice wine based on enhanced fermentation with Saccharomyces cerevisiae
1.3.3 酿酒理化参数检测 红曲酒酿造过程中，酒精含量采用气相色谱仪（7890B）进行检测分析，仪器使用条件参数参考张房宇[19]的研究报道；总酸含量检测根据国家标准 《黄酒》（GB/T 13662-2008）描述的方法进行检测；还原糖含量是采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法进行测定[20]。
1.3.4 生物胺组成及含量检测 在2 mL 离心管中加入1 mL 样品和0.05 g 聚乙烯吡咯烷酮K30，混合充分后，用恒温振荡仪于25 ℃，500 r/min 振荡15 min，4 号滤纸进行过滤，吸取100 μL 滤液到2 mL 离心管中，加入400 μL 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH 10.0），300 μL 丙酮和200 μL 丹磺酰氯溶液，混合后于60 ℃水浴1 h，用0.22 μm 有机滤头过滤，取滤液，采用高效液相色谱法测定生物胺含量，以色谱峰面积对生物胺标准品浓度进行线性回归分析，高效液相色谱条件和梯度洗脱程序参照Pineda 等[21]的方法。
1.3.5 挥发性组分及含量检测 将固相微萃取纤维头（50 μm DVB/CAR/PDMS）插入到气相色谱仪进样口（250 ℃），老化30 min，取6 mL 样品（10倍稀释），迅速装入20 mL 顶空瓶中，加入2.0 g NaCl 和10 μL 2-辛醇（质量浓度为10 mg/L），上部需留有2.5 cm 左右的空间，用封盖器封盖，放在磁力搅拌器上60 ℃加热10 min，将已老化的萃取头插入样品瓶，萃取45 min，萃取温度设置为60℃。取出固相微萃取纤维头，置于气相色谱仪进样口解吸5 min，参考Maria 等[22]的方法对麦曲黄酒挥发性风味物质进行气相色谱-质谱联用检测。
气相色谱参数和升温程序设定：初始温度设定为40 ℃，保持5 min，然后以3 ℃/min 升至120℃，保持2 min，最后以10 ℃/min 升至240 ℃，保持5 min；运行温度240 ℃，运行时间5 min；色谱柱：HP-INNOWAX 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气：高纯度氦气（纯度高于99.99%），流速1 mL/min，分流模式：不分流。质谱条件：接口温度280 ℃；连接杆温度150 ℃；EI 电离源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，质量扫描范围m/z 为35～450；ACQ 方式为Scan 模式。将测得的物质色谱图与NIST11 和Wiley 中标准谱库进行检索对比，并与相关文献报道的挥发性物质描述和保留指数相比较，确证所检出各种化学成分；通过与内标（2-辛醇）浓度的比较，测定样品中挥发性组分的浓度。
1.3.6 扩增子高通量测序分析 课题组前期利用叠氮溴化丙锭（PMA）能够在强光下与死菌DNA共价结合的特性，建立了基于PMA 前处理的红曲酒酿造微生物活菌检测技术体系[23]。选用PMA 浓度为20 μmol/L，暗处理时间为15 min，卤素灯（600 W）光照处理时间为15 min。卤素灯光照处理结束后，将菌液以4 000 r/min 离心10 min，去除上清液，无菌生理盐水清洗菌体2 次，菌体沉淀于-80 ℃冰箱暂存。PMA 处理后的菌体通过MGIEasy 微生物DNA 提取试剂盒提取红曲酒酿造微生物总DNA，选用338F（5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC A-3'）和806-R（5'-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3'）作为细菌引物，ITS5-1737-F（5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3'）和ITS2-2043-R（5'-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3'）作为真菌引物，进行PCR 扩增，将扩增产物进行DNA 文库构建，在上海美吉生物医药科技有限公司使用Illumina HiSeq 2500 仪器，对2 个文库进行扩增子高通量测序分析。根据重叠关系对下机数据进行拼接和过滤，控制和筛选序列的质量，对97%相似性以上的序列进行生物信息统计分析。所得相关结果在美吉云在线平台分析下载。
1.3.7 红曲酒风味感官品评分析 参照Yu 等[24]的方法，挑选15 名评价人员进行评定，对每杯酒样采用10 分法独立打分，评价人员在评分之前用清水漱口，评价不同样品需间隔5 min。感官品评方法参照秦连等[25]的黄酒品评技术，具体感官评价的指标包括色泽、澄清度、曲香、酸香、酱香、醇香、果香、花香、烟薰香、蜂蜜香、青草香、甜味、酸味、苦味、涩味、鲜味、协调、醇厚、柔和以及余味。
1.4 数据分析
3 个平行试验组数据结果均以“平均值±标准差”表示；利用GraphPad Prism 9.0 软件绘制折线图；通过R 语言绘制热图以及组间挥发性风味组分的差异倍数图；采用SIMCA 14.1 软件对不同发酵模式以及不同发酵阶段下的酒样进行主成分分析（PCA），显示出不同组间挥发性风味组分的差异性。
2 结果与分析
2.1 酿酒酵母强化发酵对红曲酒基本理化参数的影响
还原糖、酒精度、总酸等理化参数能在一定程度上反映红曲酒发酵过程中微生物的代谢活性，是评估红曲酒最终风味品质的重要指标。如图2a所示，空白对照组与试验组（酿酒酵母强化组）红曲酒中的还原糖在酿造初期（1～7 d）的变化趋势明显不同。具体而言，试验组红曲酒在酿造初期还原糖含量呈持续下降的变化趋势，而空白组红曲酒还原糖含量呈大幅度增加的变化趋势。这可能是由于空白组在发酵初期酵母菌等微生物数量有限，导致还原糖的代谢速度低于淀粉酶解速度，因此还原糖呈现持续累积的变化趋势。相比之下，酿酒酵母强化发酵促使淀粉被糖化菌迅速分解转化为还原糖。在随后的发酵过程中，酵母菌等微生物逐渐开始生长繁殖并大量消耗还原糖，红曲酒最终的还原糖含量趋近于零。微生物尤其是酵母菌在黄酒的酿造过程中，可将还原糖转化为乙醇，因此还原糖含量变化可在一定程度上反映酒精度的变化。在酿造初期，试验组的酒精度上升速率较快（图2b），这可能是由于酿酒酵母在发酵初期对淀粉、糊精等的转化作用较好，从而促进了酒精的产生。如图2c 所示，空白组与试验组红曲酒酿造过程中，总酸含量的变化趋势截然不同，具体表现为空白组红曲酒的总酸含量在发酵过程中呈逐渐上升的趋势，而试验组红曲酒的总酸含量在发酵过程中基本维持在2.5 g/L 左右。这可能是由于空白组红曲酒酿造过程中存在某些微生物促进酸性物质的产生，从而导致酒体酸度上升，影响了酒体口感的协调[26]。
图2 红曲酒酿造过程基本理化参数的变化趋势
Fig.2 Variation trend of basic physicochemical parameters in the brewing process of Hongqu rice wine
2.2 酿酒酵母强化发酵对红曲酒生物胺的影响
在红曲酒酿造过程中共检测到酪胺、精胺和亚精胺3 种常见的生物胺，其浓度变化趋势如图3 所示。研究结果表明，红曲酒酿造过程中总生物胺含量随着酿造时间的延长逐渐增多，在发酵终点时空白组和试验组红曲酒中的总生物胺含量分别为（175.66±3.91）mg/L 和（29.11±1.91）mg/L，酿酒酵母强化发酵对红曲酒生物胺的消减率高达83.43%。作为红曲酒中最主要的生物胺，酪胺在红曲酒酿造初期迅速增加，直至发酵结束时可达（83.55±1.83）mg/L，而酿酒酵母强化发酵能显著消减红曲酒中酪胺的生成，在酿造过程中几乎检测不到酪胺的生成（图3b）。已有研究发现，酵母菌可利用酪胺代谢的前体氨基酸（酪氨酸）转化为醇类等风味物质[27]。因此，酿酒酵母有可能与产胺菌竞争，利用发酵体系中的游离氨基酸，使得酪胺合成的前体氨基酸减少，从而有效抑制酪胺的产生。此外，对于本研究检测到的亚精胺和精胺，在红曲酒发酵过程中酿酒酵母强化发酵对其影响不大。虽然酿酒酵母强化发酵对红曲酒中亚精胺和精胺的消减效果并不理想，但这两种生物胺在红曲酒的发酵过程中含量不高且其毒性也较低[28]。
图3 红曲酒酿造过程生物胺含量的变化趋势
Fig.3 Variation trend of biogenic amines content in the brewing process of Hongqu rice wine
2.3 酿酒酵母强化发酵对红曲酒挥发性风味物质的影响
挥发性风味成分的组成及含量是评价黄酒风味品质的重要指标。本研究从红曲酒酿造过程中共检测到100 种挥发性风味成分（图4a），包括酯类42 种、醇类25 种、酸类9 种、酮类8 种、醛类7种、酚类5 种和其它化合物4 种。其中，酯类和醇类是赋予红曲酒风味的关键挥发性物质，分别占挥发性物质总量的48.4%和43.9%。已有研究表明，酯类和醇类挥发性物质对红曲酒风味品质的影响较大[29]。本文采用主成分分析（PCA）对红曲酒酿造过程中挥发性成分的组成及含量进行多元统计学分析及可视化，得到主成分分析得分图和载荷图，如图4b 和4c 所示。通过主成分分析（PCA）可以发现，酿酒酵母强化发酵对红曲酒酿造过程中挥发性风味成分有明显影响。其中，空白组主要分布于主成分分析得分图的第三、四象限，试验组主要分布于主成分分析得分图的第一、二象限（图4b）。空白组和试验组红曲酒在酿造初期挥发性成分的组成较为接近，随着酿造时间的延长，两组红曲酒的挥发性成分的组成差异越来越明显。试验组红曲酒在酿造过程中，挥发性风味组分的产生较为迅速，在发酵第3 天就开始大量产生相应的挥发性风味成分。通过热图分析（图4a）结合主成分分析载荷图（图4c）可以发现，红曲酒中大部分挥发性风味物质是在红曲酒酿造的中后期产生的，主要有2-十二烷醇[C19]、棕榈酸[C9]、壬酸乙酯[C55]、正癸醛[C37]、苯甲酸乙酯[C61]等挥发性风味组分。强化后的红曲酒中新增的挥发性风味物质有28 种，酿酒酵母强化发酵能显著提升红曲酒中新癸酸[C2]、丙乙醇[C33]、1-丁醇[C11]、辛酸乙酯[C52]、壬酸乙酯[C55]、月桂酸异戊酯[C68]、油酸乙酯[C83]等28 种挥发性风味组分的含量。其中，辛酸乙酯[C52]和壬酸乙酯[C55]具有香蕉味，月桂酸异戊酯[C68]具有花香和奶油味，1-丁醇[C11]具有甜果香味，这些挥发性化合物可赋予红曲酒独特的花果香味。以上研究结果表明，酿酒酵母强化发酵对红曲酒挥发性风味组分的生成具有积极贡献。此外，挥发性风味组分的层次聚类分析（图4d）可以进一步验证PCA 分析的结果，试验组红曲酒发酵第1 天与空白组发酵前5天在挥发性风味物质的组成上较相似，而在发酵中末期，两组间的挥发性风味物质组成差异较大。
图4 红曲酒酿造过程挥发性风味物质含量的变化趋势
Fig.4 Variation trend of the contents of volatile flavor compounds in the brewing process of Hongqu rice wine
为进一步探究酿酒酵母强化发酵对红曲酒挥发性风味组分生成的影响，对两组酒样发酵终点的挥发性风味物质含量进行对比分析。如图5所示，将两组间挥发性物质含量差异倍数≥2 且P＜0.05，认定为两组间具有显著性差异的特征挥发性风味物质，共鉴定到40 种，其中，23 种挥发性风味物质在试验组红曲酒中显著富集，17 种挥发性风味物质在空白组红曲酒中显著富集。对于醇类物质，异庚醇[C14]、6-甲基-2-庚醇[C25]、（3Z）-3-壬烯-1-醇[C27]、6-十一烷醇[C28]和雪松醇[C34]等在空白组中的丰度明显高于试验组，而异丁醇[C10]、1-丁醇[C11]、异戊醇[C12]、3-乙氧基-1-丙醇[C16]、2-十二烷醇[C19]和香茅醇[C30]等在试验组中的丰度明显高于空白组。有研究表明，适量的异丁醇和异戊醇有助于提升酒体的醇香和口感的协调[30]。在酯类物质方面，癸酸甲酯[C42]、乙酸异戊酯[C45]、辛酸乙酯[C52]、3-羟基丁酸乙酯[C54]、丁内酯[C59]、苯甲酸乙酯[C61]、9-癸酸乙酯[C63]、戊二酸乙酯[C64]和丁二酸丁酯[C66]等特征酯类物质在试验组红曲酒中明显富集，这些酯类物质可赋予红曲酒丰富多样的香气特征，其中乙酸异戊酯[C45]和戊二酸乙酯[C64]呈现苹果味和香蕉味，而辛酸乙酯[C52]和苯甲酸乙酯[C61]则呈现甘菊、玫瑰等花香，3-羟基丁酸乙酯[C54]具有极为特别的棉花糖和烤坚果的味道；在空白组红曲酒中较为突出的酯类物质为乳酸乙酯[C51]、乳酸异戊酯[C57]、丙二酸二乙酯[C58]、丁酸丁酯[C69]、丁酸丙酯[C70]和肉豆蔻酸乙酯[C74]，这些酯类物质可赋予红曲酒菠萝味和蜂蜜味。除此之外，酸类化合物中的正庚酸[C1]在空白组中相对含量较高，癸酸[C2]则在试验组中富集。对醛酮类化合物而言，空白组在甲缩醛[C39]、2-乙基苯甲醛[C41]等物质上表现优异；而1-壬醛[C36]、正癸醛[C37]、2-庚酮[C84]和2-辛酮[C86]则在试验组中显著富集，可赋予红曲酒独特的柠檬、橙皮等香味。在酚类物质方面，4-乙基苯酚在空白组红曲酒中显著富集，而酿酒酵母强化发酵几乎可以完全消除红曲酒中的4-乙基苯酚。4-乙基苯酚通常被描述为草棚味、马厩味，因其嗅觉阈值较低（430 μg/L），即使是在较低的浓度下也很容易造成令人不愉快的气味[31]。因此，在红曲酒酿造过程中，很有必要对4-乙基苯酚的产生进行消减、控制，以保证红曲酒的风味品质。
图5 酿酒酵母强化发酵对红曲酒挥发性风味物质含量的影响
Fig.5 Effect of S.cerevisiae-enhanced fermentation on the contents of volatile flavor compounds in Hongqu rice wine
注：蓝色标注代表在空白组中显著富集；红色标注代表在试验组中显著富集。
2.4 酿酒酵母强化发酵对红曲酒微生物菌群组成的影响
红曲酒传统酿造体系是一个典型的“多微共酵”体系，涉及多种微生物共同参与的复杂代谢过程。本研究基于16S/ITS 扩增子高通量测序技术，解析红曲酒酿造过程中微生物菌群组成及其动态变化，揭示酿酒酵母强化发酵对红曲酒酿造微生物菌群组成的影响。在属水平的细菌菌群分析中（图6a），空白组和试验组中相对丰度≥0.01%的细菌属分别有14 种和40 种，说明酿酒酵母强化发酵对红曲酒酿造过程细菌菌群组成有着明显的影响。在红曲酒发酵初期，优势细菌菌属为克罗诺杆菌属（相对丰度达到80%以上），随着酿造时间的延长两组差异逐渐显现，克罗诺杆菌属在空白组中的相对丰度至发酵终点已降至20%以下，其在试验组的整个发酵过程中始终维持在80.40%左右。随着克罗诺杆菌属的相对丰度降低，空白组逐渐展现了乳酸杆菌属、乳球菌属、克雷伯氏菌属和片球菌属等优势菌属的分布。具体而言，乳酸杆菌属在空白组中的相对丰度先上升后下降，是发酵中期的主要优势微生物属，乳球菌属不同于乳酸杆菌属，其在发酵第3 天开始富集，相对丰度先减少后增多，逐渐成为发酵终点的主要优势细菌属。乳酸杆菌属和乳球菌属同样也是试验组中的优势菌属，相比之下，这两种优势菌属的相对丰度在试验组中较为稳定。其中，乳酸杆菌属在试验组中的占比始终在5.97%，而乳球菌属占比基本处于3.45%左右。由此可见，酿酒酵母强化发酵改变了红曲酒优势细菌属的占比，保留了红曲酒原有细菌菌群的多样性。对于真菌的属水平分析可知（图6b），空白组在发酵初期的优势真菌为红曲霉属，发酵第5 天时红曲霉属的相对丰度逐渐降低，可能是由于乙醇的产生抑制其生长。与此同时，酵母菌属开始迅速增长，相对丰度跃迁至96.73%，成为新的优势菌群。然而，试验组因酿酒酵母参与了强化发酵，所以自发酵第1 天起，酵母菌属的相对丰度始终在0.01%以上，结构较为单一。
图6 红曲酒酿造过程中微生物菌群属水平的物种组成
Fig.6 Species composition of microbial communities at the genus level during the brewing process of Hongqu rice wine
为进一步探究酿酒酵母强化发酵对红曲酒酿造微生物组成的影响，对空白对照组和试验组的微生物物种丰度进行差异分析，结果如图7 所示。在细菌属水平上共鉴定出38 种组间显著差异的菌属，而在真菌属水平上共鉴定出6 种组间显著差异的菌属。具体而言，乳杆菌属、乳球菌属、足癣菌属、魏斯氏菌属、明串珠菌属和代尔夫特菌属在空白组中的丰度明显高于试验组；克罗诺杆菌属、芽孢杆菌属、科萨克氏菌属、假单胞菌属等菌属在试验组中的丰度明显高于空白组。Zhao 等[32]认为克罗诺杆菌对发酵食品中芳香族物质的形成具有重要贡献；Zeng 等[33]的研究发现芽孢杆菌可作为一种功能性微生物，大量分泌水解酶（包括淀粉酶、酸性蛋白酶和纤溶酶），以促进发酵产品中风味的形成；Huang 等[34]的研究也表明肠球菌属可参与酯酶的生成，是发酵产品中主要的风味生产者。由此可见，克罗诺杆菌属、芽孢杆菌属和肠球菌属等细菌在试验组中富集有利于促进红曲酒中癸酸甲酯[C42]、乙酸异戊酯[C45]和辛酸乙酯[C52]等特征酯类香气物质的生成和累积，显著提升红曲酒的风味品质。Chen等[28]的研究结果表明，科萨克氏菌属与红曲酒酿造过程中生物胺的产量呈负相关，而乳杆菌属、乳球菌属与红曲酒酿造过程中生物胺的生成呈正相关，酿酒酵母强化发酵可显著降低红曲酒酿造中乳杆菌属、乳球菌属等潜在产胺菌的丰度，这可能是试验组红曲酒中生物胺含量较低的主要原因之一。对于真菌菌群而言，主要有6 种差异真菌属，均在空白组中占比更高，分别为子囊菌门、威克汉姆酵母属、毛孢酵母属、中丝酵母属、丝孢酵母属和伊萨酵母属。酵母菌具有高效的还原糖转化能力，保证乙醇发酵水平。
图7 酿酒酵母强化发酵对红曲酒酿造微生物物种组成的影响
Fig.7 Effects of S.cerevisiae-enhanced fermentation on microbial composition in Hongqu rice wine brewing at genus level
2.5 酿酒酵母强化发酵对红曲酒感官风味品质的影响
通过感官分析进一步探究酿酒酵母强化发酵对红曲酒风味品质的影响。从图8 可发现，空白组红曲酒在酸味方面表现尤为突出，而酿酒酵母强化发酵则明显减轻了红曲酒的酸味，同时还在一定程度上提升了绵延度、醇厚等口感特征，增强了醇香、酱香和花香等特征香气，这可能与酿酒酵母强化发酵显著提升的特征挥发性风味物质密切相关（图4），如辛酸乙酯[C52]、苯甲酸乙酯[C61]和肉桂酸乙酯[C80]等挥发性组分均被报道具有果香和花香味。因此，酿酒酵母强化发酵的红曲酒能够保留原有风味特征，并且酸度适中，口感更加醇厚、绵延，整体风味品质得到明显提升。
图8 酿酒酵母强化发酵对红曲酒感官风味品质的影响
Fig.8 Effects of S.cerevisiae-enhanced fermentation on flavor sensory quality of Hongqu rice wine
3 结论
本研究采用酿酒酵母对红曲酒酿造进行原位强化发酵，系统研究其对红曲酒酿造过程中生物胺和挥发性风味组分的影响，以及对酿造微生物菌群组成的调控作用。理化检测与挥发性组分分析结果表明，酿酒酵母强化发酵不仅能明显降低红曲酒生物胺的产生，还能有效降低红曲酒的酸度，促进红曲酒中特征香气组分的生成，实现了降低生物胺、提升风味品质的双重调控效果。基于扩增子的微生物组高通量测序分析结果表明，酿酒酵母强化发酵可明显降低红曲酒酿造体系中乳杆菌属、乳球菌属、魏斯氏菌属、明串珠菌属等潜在产胺菌的相对丰度。感官风味品评分析结果表明，酿酒酵母强化发酵酿造的红曲酒，酸度适中，口感更加醇厚、绵延，整体风味品质得到明显提升。因此，本研究构建的基于酿酒酵母强化发酵的红曲酒酿造调控技术，对红曲酒酿造过程中生物胺的消减以及风味品质的形成都具有积极作用，有助于提升红曲酒的饮用舒适度及安全性，促进我国红曲酒酿造产业的健康可持续发展。然而，本研究尚未对相关微生物及其代谢产物进行统计学及代谢通路关联分析，无法明确酿造微生物与生物胺及特征风味之间的关系。后续研究可通过酿造菌群的多维宏组学研究，深入探究酿酒酵母强化发酵对红曲酒生物胺及风味品质形成的调控途径，为提升我国黄酒的饮用安全性和风味品质提供科学依据。
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