花青素，作为类黄酮化合物的一种，是一种重要的水溶性天然色素。花青素具有类黄酮典型的C6-C3-C6 的碳骨架结构（图1），含有两个苯甲酰环（A、B 环）和一个含氧六元杂环（C 环）。游离态的花青素在自然界中存在较少，常通过糖苷键与葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等连接形成花色苷[1]。花青素的抗氧化、抗炎等生理活性及其在调节肠道菌群、预防或者辅助治疗糖尿病和高胆固醇血症等慢性疾病的生理保健功效被广泛认可[2-3]。花青素虽具有众多功效，但其化学性质活泼，其分子中的2-苯基苯并吡喃阳离子结构的羟基化会降低其稳定性[4]。在提取纯化、分离鉴定或者加工储存中，花青素的理化稳定性常受到金属离子、温度、光照、氧气、酶、pH 值等因素的影响[5]。花青素进入人体后，对胃肠道pH 值和消化酶也非常敏感，导致生物利用率有所降低[6]。探究影响花青素稳定性的因素具有重要的意义。
图1 花青素的基本结构
Fig.1 Basic chemical structure of anthocyanins
影响花青素稳定性的因素主要包括其自身的结构、温度、pH 值、酶、光照、氧化剂、还原剂以及金属离子等[1，7-8]。花青素属于热敏性成分，高温会破坏花青素的结构[7，9-10]。汪志慧等[7]探究金属离子对莲房原花青素稳定性的影响时发现，Fe2+、Fe3+、Al3+、Pb2+等金属离子对花青素有明显的破坏作用，导致原花青素褪色，产生沉淀等。Mg2+、Zn2＋或Fe2+的存在不利于落叶松松塔原花青素热稳定性的保持，而还原剂NaHSO3 的存在会提高原花青素的热稳定性[8]。黑果枸杞花青素的保留率会随pH 值的增大而降低，抗坏血酸、迷迭香、茶多酚、木糖醇可减少花青素在水相体系中的氧化[11]。
关于影响花青素稳定性的研究很多，而其在食品加工中稳定性的变化机制尚未清晰。黑米为一种重要的有色稻米，其麸皮中积累大量的花青苷[12]。黑米中花青素组分单一，主要组分为矢车菊素-3-葡萄糖苷[13]。本文以黑米花青素为原料，进行不同条件的热处理和离子处理，测定花青素的保留率、色度、抗氧化活性等指标，探究温度和金属离子对黑米花青素稳定性的影响，从而获得高稳定性花青素产品的制备条件，为有色米饭的营养、色彩控制提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
花青素（来源于黑米花青素，经纯化后纯度为74.42%），湖北紫鑫生物科技有限公司；无水乙醇、氢氧化钠、氧化钾、磷酸氢二钠、盐酸、DPPH、氯化亚铁、硫酸亚铁、铁氰化钾等，国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器
JAI2002 电子天平，上海分析仪器制造厂；722S 紫外-可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；UltraScanVIS 色差仪，美国Hunterlab 有限公司；F-4500 荧光分光光度计，日本株式会社日立制作所；Acuity UPLC 高效液相色谱、Vion IMS Qtof 质谱仪，美国Waters 公司。
1.3 方法
1.3.1 温度和金属离子处理对花青素稳定性的影响
1.3.1.1 花青素的纯化 参考He 等[14]的方法，在含有柠檬酸和磷酸氢二钠的pH 3.0 缓冲液中加入称量好的花青素样品，配置成质量浓度为1 mg/mL 的溶液，通过3 ku 超滤膜，4 000 r/min 的转速离心15 min，超滤去除多糖、蛋白质等大分子物质。将滤液负载于AB-8 树脂柱（25 mm×100 mm），分别用50%，70%和80%的乙醇溶液梯度洗脱，并收集洗脱液至无色为止。将洗脱液于旋转蒸发仪内40 ℃减压去除乙醇，再冷冻干燥，得到纯化后的花青素粉末，用pH 示差法[15]检测花青素的纯度。取0.025 mol/L 的pH 1.0 的KCl 缓冲溶液和0.4 mol/L 的pH 4.5 的CH3COONa 缓冲溶液各9 mL，分别加入需检测的花青素样品1 mL，以去离子水为空白对照，分别测定其在波长510 nm 处的吸光度值（A510nm）和在波长700 nm 处的吸光度值（A700nm）。
式中：A 为吸光度；Mw 为分子质量，g/mol，以矢车菊素葡萄糖苷作为计量标准，Mw=449.2 g/mol；ε 为消光系数，以矢车菊素葡萄糖苷作为计量标准，ε=26 900；DF 为稀释倍数，10 倍。
1.3.1.2 花青素的鉴定 采用高效液相色谱设备，配合质谱仪和C18 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）对提纯的花青素进行鉴定。流动相为0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），流速为0.3 mL/min。梯度洗脱程序为：洗脱条件为0～10 min，5%～20% B；10～22 min，20%～40% B；22～28 min，40%～60% B；28～38 min，60%～65% B；柱温为25 ℃，进样量为3 μL。质谱条件：正离子模式电喷雾电离（ESI+）、毛细管电压3 kV、离子源温度120 ℃、去溶剂温度450 ℃、锥孔电压30 kV、锥孔气流50 L/h、去溶剂气流800 L/h、碰撞能量6 eV、质荷比检测范围100～1 000。样品质量浓度约为1 000 mg/mL，进样量1 μL。
1.3.1.3 样品前处理 100 mL 蒸馏水中加入20 mg 纯化后的花青素。配置0.2 mg/mL 的花青素溶液，随后进行不同程度的加热和离子处理。
1.3.1.4 加热处理对花青素稳定性的影响 取一定量配置好的花青素溶液于10 mL 离心管中，放置于60，70，80，90，100 ℃的恒温水浴锅中，分别在0，2，5，10，20，30，40 min 时取样后测定吸光度值。热稳定性分析的参数用色素保留率表示，其计算方法参考杨朝霞[16]的方法。
式中：A 为处理后的吸光度值；A0 为处理前的吸光度值。
根据非线性方程（5）拟合得到上述保留率相对于加热时间的曲线，得出平衡浓度和速度常数，以阿伦尼乌斯方程（6）求出活化能（Ea）。
式中：y 为保留率，%；c 为平衡浓度，mmol/L；k为速度常数，mol/L·s；t 为加热时间，min；k0 为频率因子，L/mol·s；Ea 为活化能，kJ/mol；R 为气体常数，8.314 J/（mol·K）；T 为热力学温度，K。
1.3.1.5 金属离子处理对花青素稳定性的影响 分别将一定量的Na+和Ca2+加入到定量的花青素溶液中，使离子浓度最终达到20 mmol/L。不同离子强度单因素设定为0，10，20，30，40 mmol/L，热处理时间为30 min，温度为90 ℃。
1.3.2 花青素色度测定 参照樊小静等[17]的方法并稍加修改。取经过不同条件热处理的花青素溶液5 mL，冷却至室温后，在透射模式下用色差仪测定样品色度，记录L*、a*、b*值。L*（亮度）、a*（红度）、b*（黄度）表示颜色坐标。
1.3.3 花青素官能团的测定 花色苷单体用水溶解，最终质量浓度为0.2 mg/mL（花青素用水溶解，最终质量浓度为0.2 mg/mL）。加热处理后冷却至室温，在波长200～700 nm 范围进行紫外-可见光扫描，每个样品设置3 个平行。
1.3.4 抗氧化能力测定
1.3.4.1 DPPH 自由基清除率的测定 根据Kumar 等[18]的方法，稍加修改，测定花青素溶液体系的2，2-二苯基-1-三硝基肼（DPPH）的自由基清除活性。取1 mL 经过不同处理后的样品与3 mL现配的DPPH 甲醇溶液混合均匀，避光反应30 min。在波长517 nm 处测定吸光度值Ai，等体积的蒸馏水代替样品溶液为对照组A0，等体积的无水乙醇代替DPPH 为空白组Aj。DPPH 自由基清除率参考式（7）计算。
1.3.4.2 羟自由基清除率的测定 取1.0 mL 样品溶液，分别加入1.0 mL 邻二氮菲（0.75 mmol/L）、2.0 mL 的磷酸盐缓冲液（pH=7.4）和1.0 mL 的FeSO4 溶液（0.75 mmol/L），混合均匀后加入1.0 mL 的H2O2（0.01%），37 ℃水浴保温60 min，然后测定其在波长536 nm 处的吸光度值。羟自由基清除率参考式（8）计算。
1.3.4.3 还原能力的测定 参考Kumar 等[18]的方法，稍加修改。1 mL 样品溶液中加入2.5 mL 的磷酸盐缓冲液（pH 6.6，0.2 mol/L）以及2.5 mL 的铁氰化钾溶液（1%），混合均匀。50 ℃孵育20 min后，加入2.5 mL 的三氯乙酸（10%）。充分混匀后进行离心处理（3 000 r/min，10 min）。取2.5 mL 离心后的上清液，加入2.5 mL 去离子水和0.5 mL 的FeCl3 溶液（0.1%），混匀后测定其在波长700 nm处的吸光度值。还原能力用吸光度值表示。吸光度值越大，表示还原力越强。
1.3.5 分子动力学模拟 分子动力学模拟可大致分为初始结构模型搭建、体系溶剂化、体系结构优化并升温，体系平衡优化以及长时间分子动力学模拟等5 个基本流程[19]。利用ChemBioDraw Ultra 14.0 画出所带电荷为1 的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷结构，导入ChemBio3D Ultra 14.0 转化为三维结构，并通过MM2 能量最小化获得能量最低的结构[20]。
优化后的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷结构利用gaff 力场生成GROMACS 所需的拓扑和坐标文件。gmx editconf 将上述体系置于立方体盒子中。所用分子动力学模拟均采用GROMACS 2021.4软件进行，选用Amber 力场，水分子采用TIP3P 模型。
所有模拟的立方水盒子均采用TIP3P 水分子模型。钠离子和氯离子添加到立方体水盒子中平衡电荷能量最小化，保持体系中性。分子动力学分为能量最小化、平衡、成品模拟3 个部分。使用最速下降法运行5 000 步，平衡阶段先在NVT 系综下使用调速温控器耦合方法运行50 000 步将体系温度升至363 K，再在NPT 系综下运行50 000步，使用Parrinello-Rahman 恒压器将体系压强保持在1×105 Pa[21]。在NPT 系综下使用蛙跳算法运行100 ns 的成品模拟。整个模拟过程中长程静电截断判定方法使用粒子网格算法，其截断距离为1.0 nm。Lennard-Jones 势能法用来判定范德华相互作用，其截断距离为1.0 nm，分子动力学过程中步长为2 fs，所有的分析均使用GROMACS 自带的分析插件。
对模拟之前和模拟之后的花青素构象用Py-MOL 进行可视化展现，其自带的Wizard-Measure-Dihedrals 测定二面角。将上述构象采用GaussView6.0 导入，采用基组6-31G（d）和基态DFT 方法分别对两构象进行几何优化和频率计算（opt+freq），采用的关键字为：# opt freq b3lyp/6-31g（d）em=gd3bj scf=qc。所有计算由Gaussian16软件完成，最后将计算结果保存为log 文件用于结果分析。
2 结果与分析
2.1 提纯花青素的鉴定
采用超高效液相色谱-质谱联用技术对黑米提取物中花青素的成分鉴定。将质谱中大量分子离子和片段离子与文献数据进行比较来鉴定该化合物。由图2a 可知，在波长515 nm 检测波长下，花色苷提取物仅在5.38 min 处有一个较大的色谱峰。由图2b 可知，提纯花青素的一级离子峰为449.10 m/z，而碎片离子峰为287.05 m/z，这是由于分子离子峰丢失一分子己糖所致，并结合参考文献[22]可以确定提纯花青素的主要成分花色苷为C3G（矢车菊素-3-O-葡萄糖苷）。
图2 提纯花青素的UPLC 分析图（a）和一级（b）、二级（c）质谱鉴定图
Fig.2 UPLC analysis of purified anthocyanins（a）and primary（b）and secondary（c）mass spectrometry identification
2.2 温度和金属离子对花青素稳定性的影响
温度对花青素稳定性的影响如图3a 所示。花青素的稳定性受加热时间和加热温度的影响。随着加热时间的延长，加热温度的升高，花青素的保留率呈下降的趋势。由图可知，在60 ℃加热40 min 时，花青素的保留率下降至85%左右。在100 ℃条件下，加热40 min 时，花青素的保留率下降至75%左右。在板栗壳原花青素稳定性的研究中[10]，也得到了类似的结论，高温下，板栗壳原花青素发生氧化聚合反应，稳定性会有所下降。因此，花青素对热的敏感性导致含花青素的产品不适宜在高温环境下加工、运输和储存。
图3 加热温度对花青素稳定性（a）及保留率拟合参数（b）的影响
Fig.3 Effects of heating temperatures on the stability of anthocyanins（a），and degradation dynamic curves of anthocyanin at different heating temperatures（b）
对花青素的保留率曲线进行拟合，拟合参数见表1。花青素在热处理中的降解数据符合一级反应动力学，这与前人的研究成果一致[5，23]。动力学速率常数k 表示花青素的降解，k 值越低，则代表花青素稳定性越高[24]。从图3b 中可以看出，花青素的降解速率常数k 随着温度的升高也呈线性增加趋势。在60 ℃时，k 值为0.0034，而100 ℃时，k 值为0.0051，说明和高温条件相比，低温环境下的花青素稳定性较强。这是因为花青素的化学结构随着温度的升高发生了改性和降解，稳定性下降，降解速率加快[24]。
表1 非线性拟合参数表
Table 1 Non-linear fitting parameter table
注：同一列中标注不同字母表示有显著性差异（P＜0.05）。
金属离子对花青素稳定性的影响如图4 所示。在Na+和Ca2+加入后，花青素的保留率会有所下降，且Ca2+对花青素的破坏作用比Na+更为明显，汪志慧等[7]在探究金属离子对莲房原花青素稳定性的影响时也证实了这一结果。从图3a 中可以看出，当加热时间小于5 min 时，也就是加热初期，Na+和Ca2+的加入在一定程度上增大花青素的吸光度，是因为金属离子在水中分解出酸，使得花青素在酸性条件下呈现不同的颜色，在加热初期对花青素有一定的护色作用[25]。然而，当加热时间大于5 min 时，金属离子的存在促进了花青素的降解。随着Na+和Ca2+浓度的增加，花青素保留率明显下降，当离子浓度达到40 mmol/L 时，Na+和Ca2+组保留率下降至75%左右，较高的离子浓度促进了花青素的降解。总体来说，花青素的保留率均呈现随温度的升高而下降的趋势，且金属离子的存在使花青素保留率显著降低。因此，含有花青素的产品在加工过程中应尽量的避免与高温和金属离子的接触。
图4 花青素在不同加热时间（a）、不同加热温度（b）、不同离子浓度（c）作用下的稳定性
Fig.4 Stability of anthocyanins under different heating time（a），temperature（b），ionic strength（c）
进一步对金属离子存在下花青素的保留率曲线进行非线性指数拟合，拟合参数见表2。与对照组相比，花青素的降解速率常数k 在20 mmol/L Na+或者Ca2+的作用下增加了约1 倍，说明花青素的稳定性在金属离子作用下遭到破坏。张乃珣等[8]指出，金属离子对原花青素的破坏，可能是由于与原花青素发生螯合，扰乱了原花青素溶液的平衡体系。
表2 花青素在离子环境下加热的非线性拟合参数表
Table 2 Non-linear fitting parameters of anthocyanins heated in ionic environment
注：同一列中标注不同字母表示有显著性差异（P＜0.05）。
2.3 温度和金属离子对花青素色度的影响
颜色是考量花青素品质的重要指标。表3 是在透射模式下利用色差仪测定花青素溶液的L*、a*、b*值结果，其中L*值代表亮度，L*值越大，说明样品亮度越高；a* 值代表红绿色度，a* 值越大，说明样品红色越深，a*值越小代表样品绿色越深；b*代表黄蓝色度，b*值越大，说明样品黄色度越深，b*值越小，代表样品蓝色度越深[26]。L*、a*、b*数值的变化可以直观地反映热处理和金属离子处理对花青素色度的影响。
表3 不同处理条件下花青素色度变化
Table 3 Chromaticity changes of anthocyanins under different treatment conditions
注：样品编号列a-b-c 中：a 表示加热温度（℃），b 表示离子浓度（mmol/L），c 表示加热时间（min），如60-0-30 表示无离子浓度，60℃条件下加热处理30 min；同一列中标注不同小写字母表示有显著性差异（P<0.05）。
在没有金属离子存在时，花青素水溶液的L*值、b* 值与加热时间和加热温度呈正相关关系，随着加热时间和温度的增加呈上升趋势，而花青素水溶液的a* 值却呈下降趋势。当加热温度为100 ℃，加热时间为30 min 时，花青素水溶液体系的L* 值和b* 值分别从22.08±0.87，9.72±0.39增加至27.18±0.54 和21.29±0.52，而a* 值从24.34±0.43 下降到23.14±0.29。当加热温度恒定，加热时间为40 min 时，花青素水溶液的L*值从22.33±0.49 增加至28.44±0.42，b* 值从5.75±0.23增加至18.42±0.38，a*值下降至23.36±0.46。花青素颜色逐渐变亮，由一开始的深红色变为浅红色。a*值没有增大反而变小，说明红色没有加深，并且b*值受温度的影响较大，黄色增加使得颜色变浅。
在金属离子的作用下，花青素水溶液体系的色度变化与没有金属离子存在时呈相同的变化趋势，即L*值和b*值随着温度和时间的增加而显著增加，a*值有所下降。在加热温度和加热时间恒定的条件下，随着金属离子浓度的增高，L*值呈现上升趋势，a*值和b*值总体呈现下降趋势。当Na+浓度上升到40 mmol/L 时，L*值上升至28.44±1.03，a* 值和b* 值分别下降至21.53±0.08 和16.88±0.82。当Ca2+为40 mmol/L 时，L*值为27.13±0.70，a*值和b*值分别为22.71±0.65 和17.19±0.45。从表3 中可以看到，低浓度的Ca2+较Na+有更大的L*值和b*值，这可能是因为Ca2+离子与花青素发生螯合作用生成螯合物[27]，使色素褪色，从而导致a*略低。郭思杙等[28]的研究表明Na+和Ca2+与其它金属离子相比，其对紫甘蓝花青素颜色稳定性无显著影响。这与本研究结论不一致，这可能是因为花青素种类不同，也有可能是因为评价指标，所用对比参数不同。
2.4 温度和金属离子对花青素抗氧化性的影响
DPPH 自由基清除法常用于评价多酚的体外抗氧化作用，已有研究表明花青素的质量浓度和DPPH 自由基清除能力呈正相关关系[29]。从图5a中可以看到，加热时间恒定时，金属离子的存在对花青素抗氧化性没有显著影响，且随着加热温度的升高，所有体系DPPH 自由基清除率没有显著变化，说明此时温度对花青素抗氧化性没有显著影响。在图5b 中，金属离子的存在，尤其是Ca2+降低了花青素的DPPH 自由基清除率，并且这种影响在加热时间为20 min 时趋于稳定。此外，当加热温度和加热时间恒定时，低离子强度（≤30 mmol/L）下，Na+对花青素DPPH 自由基清除率的影响显著高于Ca2+。
图5 不同温度、不同加热时间、和不同离子强度热处理下花青素的DPPH 自由基清除率（a～c）和羟自由基清除率（d～f）
Fig.5 DPPH radical scavenging rate（a-c）and hydroxyl radical scavenging rate（d-f）of anthocyanins under different temperature，heating time and ion intensity
注：图中标注不同字母表示有显著性差异（P<0.05）。
不同加热温度和金属离子处理的花青素体系的羟自由基清除能力如图5d～5f 所示。和DPPH 自由基清除率一样，无离子作用时温度对其影响不大，在100 ℃时加入Na+的花青素清除率仅为50%左右。随着加热时间的增加，加入Ca2+组的羟自由基清除率呈现先升高后下降的趋势，在40 min 时下降明显。随着离子强度的升高，加入Ca2+组的羟自由基清除能力较Na+组高，这说明Ca2+对花青素的活性有一定的促进作用。
图6 是加热温度，加热时间和金属离子对花青素还原能力的影响。在没有金属离子存在下，花青素溶液体系的还原能力均随着加热温度、加热时间和金属离子强度的增加呈下降趋势。在金属离子存在下，加热时间对花青素溶液体系的还原能力无显著影响。值得注意的是，高浓度的金属离子显著降低了花青素溶液体系的还原能力，整体上Na+对花青素还原能力的破坏作用更强。这是因为高浓度的离子加入后，和花青素进行螯合时，结合了带电基团，使花青素的失电子能力减弱，导致还原能力的降低[8]。
图6 不同温度（a）、不同加热时间（b）和不同离子强度（c）处理下花青素的还原能力
Fig.6 The reducing ability of anthocyanins under different temperature（a），heating time（b），ionic strength（c）
注：图中标注不同字母表示有显著性差异（P<0.05）。
2.5 温度和金属离子对花青素官能团的影响
图7a～7f 是加热温度对花青素官能团的影响。花青素单体紫外-可见吸收光谱图的最大吸收波长分别在可见光区535 nm 和紫外光区280 nm左右，说明经过热处理的花青素溶液依然具有花色苷的特征峰[30]。530 nm 的特征峰峰位置随着加热温度的增加发生蓝移，吸光度值也有所下降，这可能是因为高温破坏了取代基和助色基团。有研究指出，B 环上羟基的减少导致有机物化学结构变化，出现蓝移的现象[31]。同时从图7b 观察到，无金属离子存在时，当温度升高到70 ℃以上时，在340 nm 处出现了新吸收峰，这可能是由于花青素的结构在高温下被破坏。
图7 不加离子、加入20 mmol/L Na+和加入20 mmol/L Ca2+的花青素溶液随加热温度（a～f）和加热时间（g～l）变化的UV-VIS 图谱
Fig.7 UV-VIS spectra of anthocyanin solutions without ion，with 20 mmol/L Na+ and 20 mmol/L Ca2+ as a function of heating temperature（a-f）and heating time（g-l）
图7g～7l 是加热时间对花青素官能团的影响。在不同加热时间下，花青素单体紫外-可见吸收光谱图的最大吸收波长依然在530 nm 和280 nm 左右。没有金属离子存在下，加热0 min 时的花青素单体吸收峰明显高于加热更长时间的花青素单体的吸收峰，并且加热时间越长，花青素单体的吸收峰高度越低，这说明持续加热会显著降低峰强（即吸光度），影响花青素的稳定性，这也证明了本文前面的结论。
图8 是离子强度对花青素官能团的影响。从图中可以看出金属离子存在时，吸收峰的高度在Na+或Ca2+的影响下而降低。然而，当离子浓度达到一定值时，峰高和峰位置的变化并不明显，说明高浓度的Na+和Ca2+对花青素的影响较小。和Na+相比，加入Ca2+后，峰的高度下降更为明显，说明助色基团可能与Ca2+螯合，导致峰强降低，颜色减弱，这与色度数据相符合。金属离子导致黑米花青苷色素吸收光谱的变化，原因可能是色素分子与金属离子发生配合作用，使特征吸收峰发生变化；也有可能是因为部分金属离子在水溶液中形成水合离子本身呈现出的颜色与黑米花青素的颜色彼此复合遮蔽[30]。
图8 加入不同浓度Na+（a、b）和加入不同浓度Ca2+（c、d）的花青素溶液的UV-VIS 图谱
Fig.8 UV-VIS spectra of anthocyanin solutions with different concentrations Na+（a，b）and Ca2+（c，d）
2.6 分子动力学特性
均方根偏差（RMSD）可以反映系统是否处于平衡状态[32]。图9a 是花青素分子相对于初始结构原子位置的RMSD，可以看出花青素在90 ℃（363 K）的MD 模拟过程中构象相对于初始位置的变化。同时将其0 ns 和不同环境下的100 ns 的构象利用PyMOL 进行可视化处理（图10）。可以观察到，在前30 ns，无金属离子存在时，花青素分子构象发生了轻微变化，之后的RMSD 的振荡范围较小并逐渐趋于稳定。从图10 中可以看出，无离子组模拟后的构象对比模拟前更舒展，键角也发生了变化，更加稳定，符合RMSD 的结果。Na+加入后的RMSD 值比无离子组的RMSD 值高，说明加入Na+后花青素的稳定性受到影响，这与本文之前金属离子对花青素稳定性的影响研究结果一致。Ca2+加入后的RMSD 值振荡频率和幅度都有所增加，说明Ca2+加入后花青素中各原子的运动幅度增加，引起花青素构象变化较大[33]。花青素的构象变化就有可能导致花青素稳定性的下降。
图9 花青素分子在热和离子环境下的RMSD 值（a）和Rg 值（b）（90 ℃）
Fig.9 RMSD（a）and Rg（b）of anthocyanin molecules in thermal and ionic environments（90 ℃）
图10 花青素分子构象
Fig.10 Molecular conformation of anthocyanins
回转半径（Rg）可用于评价花青素分子结构的紧凑性。由图9b 可知，70 ns 之后的分子动力学模拟过程维持在0.41 nm 左右，趋于稳定，说明在这之后达到了平衡，构象也无较大的变化。在Na+和Ca2+的作用下，花青素的Rg 变化趋势与无离子组变化不大，也稳定在0.41 nm 附近。Na+组在55 ns左右才开始下降然后趋于平衡，这说明Na+对花青素的结构影响有一定的滞后作用，而Ca2+组未出现此现象。
2.7 相关性分析
由表4 可以看出，热处理温度与花青素溶液体系的L*值和b*呈极显著正相关关系（P≤0.01），与体系的还原能力呈显著负相关关系（P≤0.05），这是因为高温会加速花青素降解，颜色聚合度显著下降，导致活性下降，从而提高亮度和黄蓝色度。Na+与花青素溶液体系的a*和还原能力呈极显著负相关关系（P≤0.01），与体系的DPPH 清除率呈显著负相关关系（P≤0.05），说明在一定范围内，Na+浓度越高，体系的还原能力和DPPH 自由基清除率降低，a*降低。Ca2+与花青素溶液体系的羟自由基清除率和还原能力呈显著负相关关系（P≤0.05），即高浓度的Ca2+处理会降低体系的抗氧化能力。总的来说，热处理和金属离子存在均会降低花青素的DPPH 自由基清除率，羟自由基清除率以及还原能力，也就是影响花青素的抗氧化活性，并最终导致花青素的降解速率增加。
表4 加热温度和金属离子对与花青素色度、抗氧化活性和动力学参数的相关性分析
Table 4 Correlation analysis of heating temperature and metal ions on anthocyanin chroma，antioxidant activity and kinetic parameters
注：“*”表示在0.05 水平（双尾），相关性显著；“**”表示在0.01 水平（双尾），相关性显著。
3 结论
本文通过模拟典型的烹饪环境，研究了加热温度、加热时间以及金属离子处理对黑米花青素稳定性、色度和抗氧化性的影响。结果表明，加热温度和时间会影响花青素的稳定性，导致花青素的保留率下降，且降解过程遵循一级反应动力学。此外，金属离子对花青素的降解也有影响，高浓度的金属离子对花青素的降解有一定的促进作用，并且Ca2+对花青素的破坏程度较Na+大。温度和金属离子均使花青素的L* 值和b* 值增加，a* 值下降，说明了花青素的红绿色彩减少和黄蓝色彩增加。另外金属离子存在下，颜色变化较快，低浓度的Ca2+较Na+有更大的L*和黄蓝值。温度对花青素的抗氧化活性影响不大，只有随着温度的升高，略有下降的趋势。Ca2+处理后的花青素抗氧化活性略高于Na+处理后的抗氧化活性，可能是因为Ca2+与自由基的电子配对，导致了花青素的活性升高，清除率上升。在进行分子动力学模拟时，花青素在30 ns 结构有轻微重组，在之后趋于稳定，模拟之后结构舒展，离子加入后体系的稳定性下降。相关性结果表明温度作用会显著提高体系的亮度和黄蓝色度，加热处理和金属离子存在均会降低花青素的抗氧化活性和提高花青素的降解速率。
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