扇贝作为中国重要的养殖贝类之一,产量居世界首位[1]。虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)和海湾扇贝(Argopecten irradians)是中国沿海的3 种主要扇贝。其中,海湾扇贝生活周期短,生长速度较快,相对其它扇贝品种价格较低廉且味道鲜美,能够带来较好的经济效益,因而被养殖生产和消费[2]。闭壳肌,也就是贝柱,为海湾扇贝最主要的食用部位,常被单独取出食用,而同样可食用的的扇贝裙边,由于肉质不够丰满、口感不佳往往被视为废物大量丢弃,造成资源的浪费和环境的污染。不仅如此,扇贝在打捞之后的短时间内非常容易死亡并腐烂,如果处理不当,可能会给人类健康带来风险,这使得海湾扇贝的鲜销受到极大限制。通过合理的加工,将海湾扇贝裙边进行高值化利用并打破鲜销的限制,是针对上述问题行之有效的解决途径。
发酵是食品原料及其副产物高值化利用的重要方法之一。传统发酵食品,如泡菜、馒头、香肠、酸奶、面包等,在经微生物发酵后,不仅风味及品质得到提升,食材的保质期也得以延长。乳酸菌被广泛应用于食品发酵,在发酵过程中,一些乳酸菌可以促进蛋白质分解,形成短肽和游离氨基酸等物质[3],发挥提升食材风味和品质的作用。此外,一些乳酸菌还可以通过产生抗氧化物质,降低氧化程度,进而缓解酸败[4]。与自然发酵相比,接种发酵不仅可以改善食品的风味及品质,而且兼具生产效率高,过程易控制等优势[5]。植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.Plantarum)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)是肉制品中最常见的发酵菌种,在以往的研究中发现,发酵酸鱼中的植物乳杆菌植物亚种对风味形成起到重要的作用[6]。梁进欣等[7]的研究表明,将植物乳杆菌植物亚种添加到干腌鱼中,可以起到降盐增鲜的作用。Mei 等[8]发现1 株有抗氧化特征的植物乳杆菌植物亚种,可以减少发酵香肠的氧化程度,进而形成更好的风味。干酪乳杆菌可以提高发酵香肠的质量,还被应用于制作风味独特的发酵海鲜调味品。陈正荣等[9]将干酪乳杆菌应用到鱼糜发酵中,改善了产品的风味质量。Rashid 等[10]发现干酪乳杆菌发酵后的海鲈鱼内脏水解物比对照组具有更高的抗氧化能力。作为“发酵之母”的酵母菌,一方面可以通过产生醇类和酯类等风味物质来改善发酵食品的整体风味,另一方面可以通过自身代谢消耗氧气,从而减少食物自身的氧化[11]。马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)在以往的研究中被应用于肉制品和水产品的发酵中,如Gao 等[12]使用马克思克鲁维酵母和克鲁维毕赤酵母制作具有果味的新型鱼露。Li 等[13]指出接种克鲁维毕赤酵母的猪肉酶解物,挥发性醇类物质和酯类物质含量提升显著。
图1 海湾扇贝示意图
Fig.1 Schematic diagram of Argopectens irradias
微生物发酵海鲜制品味道鲜美,可以添加到酱油和食物中,是良好的天然鲜味增强剂。Zhou等[14]使用植物乳杆菌植物亚种、食窦魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides)和清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)作为发酵剂,制作低盐鲭鱼调味料。Li 等[15]分析了在低温环境下发酵的新型低盐虾酱的理化性质,为虾酱产业提供新思路。Gao等[16]在接种发酵剂,不添加食盐的情况下制备发酵鱼露,该鱼露具有很好的香气。综上,接种发酵海湾扇贝裙边具有良好的开发潜力。本文使用植物乳杆菌植物亚种、干酪乳杆菌、马克思克鲁维酵母和克鲁维毕赤酵母4 株菌作为发酵菌种,制备裙边发酵液,借助微生物发酵,提升扇贝裙边蒸煮液的风味品质,使之有可能成为调味基料。本研究不仅为扇贝裙边调味料产品开发奠定理论基础,还可为阐释微生物发酵过程中脂肪氧化和蛋白质分解对风味形成的影响提供理论依据。
新鲜海湾扇贝,购于河北省保定市农业大学科技市场;菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC):马克思克鲁维酵母FCC2181(Kluyveromyces marxianus FCC2181),植物乳杆菌亚种植物亚种Lp-4(Lactobacillus plantarum subsp.Plantarum Lp-4),干酪乳杆菌Y5-2b(Lactobacillus casei Y5-2b),克鲁维毕赤酵母F29-3-5(Pichia kluyveri F29-3-5)。
食用葡萄糖,河南亿邦化工技术公司;硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)、三氯乙酸(Trichloroacetic acid,TCA),国药集团化学试剂有限公司;PDA 培养基、MRS培养基,北京奥博星有限公司。
Trace 1300 ISQ 气相色谱-质谱联用仪,美国赛默飞世尔科技公司;7820A 气相色谱仪,美国安捷伦公司;FE28 pH 计,上海梅特勒-托利多仪器有限公司;LC-2030 Plus 液相色谱仪,日本岛津公司;均质机,中国九阳有限公司。
1.3.1 菌株培养 乳酸菌及酵母菌培养参考姜娇等[17]的方法并稍作修改。乳酸菌使用MRS 肉汤培养基,在37 ℃条件下培养24 h,连续活化2 次后备用。酵母菌使用YPD 培养基,在28 ℃条件下培养24 h,连续活化2 次后备用。发酵前,将菌株活化液在5 000 r/min 离心2 min,取用菌泥,重复2次。加入无菌生理盐水,涡旋摇匀,使菌体细胞悬浮于生理盐水中,备用。
1.3.2 扇贝裙边蒸煮液的制备 蒸煮液制备参考张彩凤[18]的方法并稍作修改。将海湾扇贝中的扇贝裙边取出,洗净。生扇贝裙边与蒸馏水按照固液比为1∶2 进行均质。倒入煮锅中加热,水沸腾后开始计时。开盖煮沸蒸发浓缩30 min,制成扇贝裙边蒸煮液。将扇贝裙边蒸煮液分装至锥形瓶,并添加2%的葡萄糖,121 ℃高压灭菌15 min。灭菌后的样品被分为5 个批次:对照组(CN)、接种FCC2181组、接种F29-3-5 组、接种Lp-4 组和接种Y5-2b组。在无菌条件下接菌,使扇贝裙边蒸煮液中初始活菌数在FCC2181 组、F29-3-5 组、Lp-4 组和Y5-2b 分别约为:106,106,107,107 CFU/mL。将装在锥形瓶中的样品放入培养箱,30 ℃培养36 h,每隔12 h,取上清液测定指标。发酵结束后再在121 ℃下高压灭菌15 min 结束发酵。用无菌的双层纱布过滤扇贝裙边蒸煮液,弃去残渣,得到发酵液。
1.3.3 发酵过程中裙边蒸煮液pH 值的测定 扇贝裙边蒸煮液发酵至0,12,24,36 h 分别取样,摇匀后使用pH 计测定pH 值。
1.3.4 发酵过程中裙边蒸煮液中活菌数的测定参考曹晓玉等[19]的方法并稍作修改,每组样品发酵至0,12,24,36 h 分别取样,涡旋摇匀,分别取出1 mL,用无菌的生理盐水进行梯度稀释。乳酸菌计数时使用MRS 培养基,37 ℃培养48 h,酵母菌计数时使用PDA 培养基,28 ℃培养48 h。选取菌落数在30~300 CFU 的平板进行计数。
1.3.5 发酵过程中裙边蒸煮液的硫代巴比妥酸值测定 将10 mL 的7.5 g/100 mL TCA 装入锥形瓶中,加入0.1 g 的乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA),充分溶解后加入发酵前、后的扇贝裙边蒸煮液样品5 mL,均质10 s,5 000 r/min 离心10 min。然后,取5 mL 上清液与5 mL 的0.02 mol/L 的三丁基铝(Tri-n-butyl aluminum,TBA)溶液在90 ℃下水浴30 min,取出后冰浴并在波长532 nm 处测量吸光度[20]。
1.3.6 接种发酵菌种对裙边蒸煮液挥发性风味物质的影响 分别取5 mL 的扇贝裙边蒸煮液和4组接种菌株后的扇贝裙边蒸煮液样品置于20 mL样品瓶中。加入内标,盖紧。用气相色谱-质谱法(Gaschromatography-mass spectrometry,GC-MS)进行分析[21]。
色谱条件如下:色谱柱为DB-WAX(30.0 m×250 μm,0.25 μm);柱温升温程序:流速:1.0 mL/min;升温程序:初始温度40 ℃,保留3 min;以5℃/min 的速率升温至90 ℃,最后以10 ℃/min 的速率升温至230 ℃,保留7 min。进样口温度:200 ℃;检测器温度:250 ℃;载气:N2,流量0.8 mL/min,不分流。
1.3.7 接种发酵菌种对裙边蒸煮液游离氨基酸的影响 样品前处理参照刘成模等[22]的方法。流动相A:乙腈,流动相B:乙酸-乙酸钠缓冲液(2.5 g乙酸钠、1.5 mL 三乙胺和1.17 mL 冰乙酸溶于1 L水中),流速:1.5 mL/min,梯度洗脱程序见表1。
表1 洗脱程序
Table 1 Elution procedure
图2 制备扇贝裙边蒸煮液的工艺流程图
Fig.2 Process flow diagram for the preparation of irradians skirt cooking liquid
1.3.8 接种发酵菌种对裙边蒸煮液游离脂肪酸的影响 样品前处理参照韦友兵等[23]的方法,并以十一烷酸甲酯作为内标物。按照表2 和表3 条件进行分析。
表2 分析参数
Table 2 The analysis parameters
表3 升温程序
Table 3 Temperature program
注:“-”表示在该阶段温度保持恒定,不进行升温。
1.3.9 接种发酵菌种对裙边蒸煮液感官的影响10 名人员对发酵前、后的扇贝裙边蒸煮液进行感官评价。每个样品取2 mL 倒入透明塑料杯中,杯子上标记随机数字。以10 分制对每种感官属性进行打分(鲜味、甜味、酸味、肉味、油脂味、腥味和腐臭味及整体喜爱度),其中,0 分代表无这种风味,10 分代表风味极强,5 分代表中等强度。
1.3.10 数据分析 采用SPSS 23.0 软件进行邓肯多元比较法分析差异的显著性,P<0.05 代表显著性差异使用。Origin 2021 对样本进行载荷图可视化分析。
扇贝裙边蒸煮液发酵过程中的菌株生长曲线如图3 所示。两株乳酸菌和两株酵母菌生长情况良好。植物乳杆菌植物亚种Lp-4 接种的发液中活菌数由7.04 lg(CFU/mL)增长至8.49 lg(CFU/mL)。干酪乳杆菌Y5-2b 接种的发液中活菌数由6.99 lg(CFU/mL)增长至8.17 lg(CFU/mL)。马克斯克鲁维酵母FCC2181 和克鲁维毕赤酵母F29-3-5 活菌数分别由5.93 lg(CFU/mL)和6.07 lg(CFU/mL)增长至8.01 lg(CFU/mL)和8.18 lg(CFU/mL)。酵母菌在发酵24 h 以内生长速度较快,在发酵24 h 后增长放缓。
图3 发酵期间菌株的生长曲线
Fig.3 The growth curve of strains during the fermentation
扇贝裙边蒸煮液发酵过程中的pH 值变化如图4 所示。发酵过程中各组发酵液pH 值都显著降低。发酵结束时,接种乳酸菌的样品pH 值低于接种酵母菌的样品。发酵36 h 接种植物乳杆菌植物亚种Lp-4、干酪乳杆菌Y5-2b、马克斯克鲁维酵母FCC2181 和克鲁维毕赤酵母F29-3-5 的蒸煮液pH 值分别达到3.35,3.33,5.52,4.96。发酵过程中的pH 值降低是由乳酸菌及酵母菌代谢产生有机酸导致的[24]。
图4 发酵期间pH 值的变化
Fig.4 Changes of pH value during the fermentation
通过发酵扇贝裙边蒸煮液制得裙边发酵液,图5 为分别接种4 种发酵液的样品图。发酵终点样品色泽金黄。其中,Lp-4 组、Y5-2b 组的样品颜色较浅,FCC2181 组、F29-3-5 组样品颜色较深。
图5 发酵液样品图
Fig.5 Finished picture of fermented seasoning
注:从左到右依次为Lp-4 组、Y5-2b 组、FCC2181组、F29-3-5 组。
TBARS 值是评价脂肪氧化程度的常用指标。图6 为各发酵时间段测定各组样品的TBARS 值。从图6 可知,在发酵12 h 之后,各组样品TBARS值持续上升。接种发酵菌种的各组样品都比对照组有更低的TBARS 值,可能是因为酵母可以通过自身呼吸作用消耗氧气[4]。一些乳酸菌则可以通过分泌抗氧化物质来抑制氧化作用[25]。例如,Mei 等[8]证实了发酵香肠中乳酸菌的抗氧化作用,其抑制了TBARS 值的升高,并且对风味起到了良好的作用。在发酵36 h 时,对照组的TBARS 值最高,Y5-2b 组的TBARS 值最低,Lp-4 组的TBARS 值与对照组最接近。不同样品中的TBARS 值反映了接种微生物对裙边蒸煮液脂质氧化的影响。4 种菌种的抑制脂肪氧化的能力从高到低依次是:Y5-2b组、F29-3-5 组、FCC2181 组、和Lp-4 组。
图6 发酵前、后裙边蒸煮液的硫代巴比妥酸值
Fig.6 Thiobarbituric acid value of cooking liquor before and after fermentation
注:不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。
用5 组样品中的挥发性风味物质浓度绘制弦图(图7)。从图7 中可以看出,相比于对照组,4 种发酵菌种发酵的蒸煮液中检测出了更高浓度的风味物质,说明发酵促进了裙边蒸煮液风味的形成。在接种发酵菌种的4 组样品中,接种马克斯克鲁维酵母FCC2181 的样品风味物质含量最高;接种植物乳杆菌植物亚种Lp-4 的样品风味物质含量最少。另外,通过对比各批次样品中醇类、醛类、酮类、酸类、酯类及其它类风味物质的变化,可以更加清晰地观察不同发酵菌种对裙边蒸煮液各风味物质的影响。结果显示:接种马克斯克鲁维酵母FCC2181、克鲁维毕赤酵母F29-3-5 的2 个批次的样品较其它组相比产生了更多的醇类;而接种植物乳杆菌植物亚种Lp-4 的样品和接种干酪乳杆菌Y5-2b 的样品产生了更多的酸类物质;接种4 种发酵菌种的样品中检测到了比对照组更多的酯类物质,说明发酵促进了酯类物质的生成;醛类物质在各组中占比都较高,其作为肉制品及水产品中重要的特征风味来源,对样品风味起到重要的作用。
图7 发酵前、后裙边蒸煮液的挥发性风味物质浓度弦图
Fig.7 Chord diagram of the concentration of volatile flavor substances in the mantle cooking liquor before and after fermentation
注:图中不同长度的线段表示菌种与风味物质间之相关性的强度,线段越长表示菌种与对应的风味物质之间相关性越强。
接种不同发酵菌种的裙边蒸煮液挥发性风味物质的含量见表4。在发酵前、后的扇贝裙边蒸煮液中共检测出100 种挥发性风味物质,其中,对照组52 种,Lp-4 组53 种,Y5-2b 组42 种,FCC2181组48 种,F29-3-5 组53 种。
酯类物质可以由微生物通过酯化反应产生,其主要提供果香。有研究发现,酵母菌和乳酸菌发酵作用可以促进酯类物质形成,这与本文的结果相似。另外,结果显示乙酯类化合物含量在Y5-2b组、FCC2181 组中增加,尤其是在FCC2181 组中增加显著,这可能与FCC2181 组中由酵母菌代谢产生的乙醇有关。增加的乙酯类包括己酸乙酯、月桂酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕榈酸乙酯等。酯类物质对样品产生更好的感官品质贡献重要的力量,其在发酵后的4 组样品中检测到比对照组更高的含量。在FCC2181 组和F29-3-5 组样品中检测到较高的酯类物质含量可能与其代谢过程中产生的醇类物质有关,这些醇类可以作为酯类物质的合成前体。然而,并不是所有菌株都会通过发酵促进酯类物质的产生,产酯能力也与菌株性质有关。例如,Chen 等[26]将乳酸菌接种到猪肉肌浆蛋白中,在接种的发酵样品中并未检测到酯类物质的提高。
醇类物质为发酵制品提供特殊的清香味道,可以为发酵水产品提供具有代表性的独特风味,例如日本和泰国的鱼露中均含有3-甲基-1-丁醇、乙醇、辛醇、丙醇等醇类物质[27]。碳水化合物代谢、脂质氧化和氨基酸脱羧是醇类物质的主要来源[28]。醇类物质在接种酵母的FCC2181 组和F29-3-5 组样品中增加较明显,这与酵母的代谢特性有关。直链的一级醇对风味影响较小,而随着碳链增长,醇类呈现出清香和脂肪香,包括1-辛烯-3-醇在内的一些不饱和醇,因阈值较低,较大程度地影响着风味[29]。
醛类在各组样品中含量较高,其主要来自于脂肪氧化和氨基酸降解作用[30]。壬醛、己醛、庚醛和辛醛,这些醛类作为脂肪族醛类,在Lp-4 组中具有较高的含量,而在Y5-2b 组含量较低。这些醛类来源于不饱和脂肪酸的氧化,其含量出现的显著差异可能与菌株抑制氧化的能力有关。大多数支链醛则主要由支链氨基酸的降解产生,例如:发酵后显著升高的苯甲醛,有杏仁的香甜味道。
酸类是发酵制品中具有特殊风味的成分,可能由脂质氧化产生,也可能源于氨基酸降解或糖代谢[31]。其在Lp-4 组和Y5-2b 组检测到更高的含量。酮类源于脂质氧化,在发酵后的样品中,酮类在Lp-4 组检测到最高值,其次是F29-3-5 组。这可能与菌株的抑制脂肪氧化能力有关。另外,一些酮类物质由发酵产生,如3-羟基-2-丁酮,其具有奶香味,在对照组中未检测到,在Lp-4 组、FCC2181 组和F29-3-5 组中显著增加。
游离氨基酸不仅是滋味的主要贡献者,还可以作为风味物质的前体[32]。为了评估发酵菌种对蒸煮液中蛋白质分解的影响,对5 组样品进行游离氨基酸含量的测定,结果如表5 所示。发酵后的各组样品中总游离氨基酸含量显著增加,说明在发酵过程中,微生物分泌的蛋白酶显著促进了蛋白质的分解。FCC2181 组中总游离氨基酸含量最高,其次是Y5-2b 组,这意味着马克斯克鲁维酵母和干酪乳杆菌对裙边蒸煮液中蛋白质的降解作用更显著。F29-3-5 组与Lp-4 组游离氨基酸总量虽然没有显著差异,但也高于对照组。谷氨酸是鲜味氨基酸,其含量在发酵后的各组样品中显著增加。鲜味氨基酸天冬氨酸在F29-3-5 组、Y5-2b 组中含量与对照组没有显著性差异,在Lp-4 组和FCC2181 组中含量下降。丙氨酸含量在发酵后的各组样品中含量显著增加,其中,在FCC2181 组中含量最高。一些文献指出,丙氨酸可以增强酱油的鲜味[14]。
表5 接种不同发酵菌种对蒸煮液的游离氨基酸组成的影响
Table 5 Effects of inoculating different fermentation strains on free amino acid composition of cooking liquid
注:上角标中标注的不同字母代表样品间的显著性差异(P<0.05)。
表6 接种不同发酵菌种对蒸煮液的游离脂肪酸组成的影响
Table 6 Effects of inoculating different fermentation strains on free fatty acid composition of cooking liquid
注:不同字母代表样品间的显著性差异(P<0.05),“—”表示未检出。
游离脂肪酸经氧化后形成大量风味物质[33]。图8 为游离脂肪酸的含量变化图。结果显示,样品中的游离脂肪酸以饱和脂肪酸(Saturated fatty acid,SFA)为主,不饱和脂肪酸中含量较高的是多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA),而最强烈的氧化损失发生在多不饱和脂肪酸中[34]。有研究表明,不饱和脂肪酸更容易被氧化[35]。壬醛和辛醛在Lp-4 组中具有较高的含量,而在Y5-2b 组含量较低,其被认为是油酸的氧化产物。与TBARS 值相对应的是,Lp-4 组游离脂肪酸氧化损失量最多,Y5-2b 组游离脂肪酸氧化损失量最少。这在一定程度上反映了菌株的抗氧化能力对游离脂肪酸氧化作用的影响。
图8 发酵前、后裙边蒸煮液的游离脂肪酸含量
Fig.8 Free fatty acid content of cooking liquor before and after fermentation
注:不同小写字母表示组别之间的显著性差异(P<0.05)。
图9 发酵前、后蒸煮液的感官评分
Fig.9 Sensory evaluation of cooking liquor before and after fermentation
各种研究表明,由脂肪分解产生的游离脂肪酸是风味物质的主要前体,而脂质氧化进一步形成的挥发性化合物也是肉制品形成其特征风味的重要因素[36]。在发酵前、后的5 组样品中共检测到15 种游离脂肪酸。棕榈酸、硬脂酸和二十二碳六烯酸是发酵前、后蒸煮液中主要的游离脂肪酸。有研究表明,棕榈酸与肉味具有显著相关性,硬脂酸也与风味有较高的相关性[37]。在发酵过程中,游离脂肪酸的含量整体呈下降趋势,说明在发酵过程中游离脂肪酸发生了氧化作用,这与一些风味物质的形成有关。适度的脂肪氧化可以形成肉类的典型风味,而过度的脂肪氧化会导致酸败而对食品的风味产不良影响。
对发酵前、后的5 组样品进行感官评分,包括鲜味、肉味、酸味、油脂味、甜味、腥味、腐臭味和整体喜爱度。发酵后各组样品的腥味下降,这是微生物代谢的结果。发酵后各组样品酸味增加,这与微生物代谢产生的挥发性酸类物质有关。FCC2181和F29-3-5 组的甜味增加,是由于与酵母代谢生成的醇类物质和酯类物质。接种马克斯克鲁维酵母FCC2181 的批次的整体接受度显著高于其它组,其次是接种克鲁维毕赤酵母F29-3-5 的批次,接种植物乳杆菌植物亚种Lp-组整体接受度最低,可能是因为其发生了最强烈的氧化作用。感官评分的结果与挥发性风味物质的结果相对应。
本文使用植物乳杆菌亚种植物亚种Lp-4、干酪乳杆菌Y5-2b、马克思克鲁维酵母FCC2181、克鲁维毕赤酵母F29-3-5 做为发酵菌种改善扇贝裙边蒸煮液的风味品质,发酵后的样品中检测出了更高浓度的风味物质。其中,接种马克思克鲁维酵母FCC2181 的样品风味物质含量最高;接种植物乳杆菌亚种植物亚种Lp-4 的样品风味物质含量最少;接种马克思克鲁维酵母FCC2181、克鲁维毕赤酵母F29-3-5 的2 个样品较其它组相比产生了更多的醇类;而接种植物乳杆菌亚种植物亚种Lp-4 的样品和接种干酪乳杆菌Y5-2b 的样品产生了更多的酸类物质;接种4 个菌种的样品中都检测到了比对照组更多的酯类物质。Y5-2 组和Lp-4 组因具有不同的抗氧化能力而形成了游离脂肪酸含量差异和风味成分的差异。壬醛、己醛、庚醛和辛醛,这些源于不饱和脂肪酸氧化的脂肪族醛类,在Lp-4 组中具有较高的含量,而在Y5-2b 组含量较低。另外,FCC2181 组的游离氨基酸含量最高,其风味物质总量最高,且生成了最多含量的酯类物质。本研究结果表明,乳酸菌发酵赋予海湾扇贝裙边较多酸类风味物质,酵母菌发酵赋予较多醇类物质,为扇贝裙边调味料产品开发奠定了理论基础。
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Effects of Different Strains of Bacteria on the Quality and Flavor of Rgopecten Skirted Fermentation Liquid