食醋在后工序、陈酿、运输、销售过程中可能因残留或二次污染微生物而导致食醋发生产气（胀气）、发黏等变质现象。食醋生产企业陈酿大罐贮存过程中发生产气，或预包装食醋产品出现产气，甚至胀壶或暴瓶现象，影响食醋品质以及增加二次加热及去除沉淀等生产成本。这不仅对食醋行业造成一定经济损失，还带来一系列的食品安全问题。张怀敏等[1]采用传统培养法从产气老陈醋中分离得到1 株产气微生物，结合生理生化指标鉴定，该菌为芽孢杆菌（Bacillus sp.）。栾春光等[2]采用高通量测序结合实时定量PCR 检测技术对涨壶食醋微生物进行鉴定，结果表明造成食醋涨壶的主要微生物为芽孢杆菌。
乳酸菌可以通过氨基酸代谢、脲酶体系、柠檬酸盐代谢等来维持胞内pH 值的稳定，从而提高耐酸能力。张彦位等[3]通过添加外源天冬氨酸使得干酪乳杆菌（Lactococcus casei）在pH=3.6 条件下存活率提高11.11 倍，胞内ATP 含量提高42 倍。Zhang 等[4]通过添加外源谷胱甘肽使乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）SK11 在pH=4.0 中存活率提高了15.9 倍。食醋中氨基酸含量可达3 311.5 mg/dL[5]，而氨基酸代谢能有效提高乳酸菌的耐酸性，这导致除芽孢杆菌外，乳酸菌使食醋变质成为可能。Entani 等[6]首次从日本变质的谷物醋中分离鉴定出耐酸乳酸菌（Lactobacillus acetotolerans），该菌生长缓慢，能引起谷物醋浑浊变质。Wang 等[7]从产气变质食醋中分离得到金山醋酸乳杆菌（Acetilactobacillus jinshanensise）的一个亚种Z-1（Acetilactobacillus jinshanensis subsp.aerogenes），研究表明该亚种在食醋中有产气能力。
宏基因组测序可以系统展示某一体系全部微生物DNA 信息，能够将物种注释到种乃至菌株水平，并可对该微生物种群进行功能及代谢通路分析，为研究该体系基因功能提供有效的方法[8]。刘爱平等[9]基于宏基因组测序分析四川麸醋醋醅中微生物组成，为揭示风味形成机制奠定了基础。Wu 等[10]采用宏基因组测序揭示了镇江香醋的微生物组成以及其功能。目前未见运用宏基因组测序解析产气变质食醋微生物组的相关研究。本研究以产气食醋为研究对象，采用传统分离培养法结合宏基因组技术分析其微生物组成和代谢功能，研究了优势微生物可能存在的耐酸基因，为产气变质食醋中微生物的深入研究及其防控提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 产气食醋 采集经热灭菌进入陈酿大罐中的6 g/100 mL 食醋样品，由取样阀无菌取出，装于无菌塑料瓶中，每瓶500 mL，共3 瓶，放置于37℃恒温培养出现产气，编号YJC；在YJC 出现产气后，再从该陈酿大罐中无菌取样3 瓶，每瓶500 mL，37 ℃培养2～3 d，待装有醋液的塑料瓶发生产气现象，说明大罐醋液出现产气变质，编号CD，食醋样品来源于四川某麸醋厂。
传代产气食醋样品：将总酸6 g/100 mL 醋液与水以体积比2∶1 混合，添加质量浓度10 g/L 葡萄糖，121 ℃灭菌15 min，制备成总酸4 g/100 mL的醋液。再将CD 醋样按10%接种量接于总酸4 g/100 mL 的醋液中，37 ℃培养7～10 d，待发生产气现象后编号为YJCD，重复3 次。
1.1.2 试剂 FastDNA SPIN Kit for Soil 试剂盒，MP Biomedicals 公司；PCA 培养基、MRS 培养基、醋酸菌培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；改良MRS 培养基，由四川农业大学食品学院研发[7]。
1.1.3 仪器与设备 LDZF-75L-1 高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；Stratos16R 多功能高速冷冻离心机，Thermo Electron Corporation；LRH-150F 生化培养箱，上海浦东荣丰科学仪器有限公司；SW-CJ-1F 超净工作台，杭州川一实验仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 产气食醋微生物分离鉴定 将YJC、YJCD、CD 产气食醋样品，用无菌生理盐水进行梯度稀释，取100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5 的样品1 mL 于无菌培养皿，分别倾注PCA 培养基、MRS 培养基、醋酸菌培养基、改良MRS 培养基置于37 ℃下进行厌氧和好氧培养，每个稀释梯度做3 个平行。将分离得到菌落经平板划线2～3 次进行纯化。将分离得到的菌株接种于装有杜氏小管的5 mL总酸4 g/100 mL 的醋液中观察是否导致食醋出现产气变质[11]，将导致食醋产气的菌株送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行16S rDNA 测序。
1.2.2 DNA 的提取及送样测序 将各组产气食醋样品离心（8 000 r/min，10 min，4 ℃），收集菌体沉淀约0.1 g，按FastDNA SPIN Kit for Soil 试剂盒说明书步骤提取样品中总DNA，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行宏基因组测序。
1.2.3 生物信息学分析
1.2.3.1 数据拼接 基于Hiseq 原始测序数据，使用BWA 软件去除宿主序列，Fastp 软件进行质控，得到高质量reads。使用Megahit 软件对序列进行拼接，选择最佳拼接方法，获得Contings，并进行基因预测。
1.2.3.2 非冗余基因集构建 用CD-HIT 软件进行聚类，每个类取最长的基因作为代表序列，构建非冗余基因集。
1.2.3.3 数据库注释 使用DIAMOND 软件将非冗余基因序列与NR 数据库（Non-Redundant Protein Sequence Database）、Egg-NOG 数据库（evolutionary genealogy of genes：Non-supervised Orthologous Groups）、KEGG 数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）、CARD 数据库（Comprehensive Antibiotic Resistance Database）、VFDB 毒力因子数据库进行比对，对比类型为BLASTP，使用hmmscan 工具将非冗余基因集与CAZy 数据库（Carbohydrate-active enzymes）进行比对，以上比对参数均设置期望值e-value 为1×10-5，完成丰度计算和功能注释。
1.2.3.4 统计分析和作图 采用Origin2022 和R软件完成作图。以上生物信息学分析均采用美吉生物云平台（www.majorbio.com）。
2 结果与分析
2.1 产气变质食醋微生物分离及鉴定
采用PCA 培养基、MRS 培养基、醋酸菌培养基、改良MRS 培养基对产气变质食醋进行微生物分离，仅改良MRS 培养基厌氧培养下检出菌落（如图1），其菌落形态为边缘整齐，圆形，表面湿润，呈黄白色，革兰氏染色呈阳性，菌体呈长杆菌，无芽孢。牟娟等[12]采用PCA 培养基、虎红培养基、醋酸菌分离培养基、MRS 培养基均未从胀气食醋中检测出微生物，而对其进行镜检发现胀气食醋中存在革兰氏阳性菌。该结论与本研究结论一致，采用普通培养基不能检测出引起食醋变质的微生物。分别从YJD、YJCD、CD 食醋样品中共计分离得到23 株菌，将上述菌株回接与食醋中均可导致食醋发生产气变质现象，16S rDNA 测序结果表明23 株菌均为金山醋酸乳杆菌，结果与Wang 等[7]相一致。Yu 等[13]首先从镇江香醋醋醅中分离得到金山醋酸乳杆菌，该菌能在pH 值为3.0～5.0（最适pH=4.0），温度为20～40 ℃（最适为35 ℃）条件下生长，能够耐受成品醋的高酸性环境。金山醋酸乳杆菌不仅是食醋酿造中的优势微生物，该菌在白酒酿造过程中同样也发挥着重要作用。邢敏钰等[14]通过相关性分析表明该菌含量与原酒质量呈正相关关系，在发酵过程中扮演重要角色。
图1 产气食醋分离细菌菌落形态及菌体形态（1 000×）
Fig.1 Colonial and mycelial morphology of strain isolated form gas-producing vinegar（1 000×）
2.2 宏基因组测序和质量控制
本研究对YJC、YJCD、CD 组（n=3）共计9 个样品进行了宏基因组测序，结果显示9 个样品共产生了423 670 626 个总长约为6.4×1010 bp 的Raw reads，去除低质量数据后，Clean reads 占97%以上。拼接得到Conting 数较小，中位数为575。通常认为N50 值（N50 表示将contigs 由大到小叠加至总长的50%时对应的contigs 长度）越大，拼接效果越好；本文拼接数据显示N50 值中位数为153 869，最小值大于500，说明本次组装效果良好，可用于后续试验分析[15]。
2.3 物种水平分析
表1 为基于种水平的Alpha 多样性分析，结果表明CD 组和YJC 组的Chao1 指数和ACE 指数显著大于YJCD 组，说明CD 组和YJC 组群落丰富度显著大于YJCD 组群落丰富度。Shannon 指数综合菌群组成丰富度与均匀度，从而反映样本多样性，数据显示YJCD、CD 组和YJC 组多样性无显著差异，推测导致YJCD 组中群落丰富度较低的原因可能为：总酸4 g/100 mL 的醋液中原有的微生物DNA 经高温灭菌后被降解，接种后培养7～10 d 后优势微生物繁殖导致出现产气现象，而非优势微生物繁殖较慢尚未到达检出水平，从而YJCD 组中物种丰富度较CD 组、YJC 组低。Venn图可以比较直观地反映出样品的相似性和重叠情况，图2 为种、属水平Venn 图。从属水平分析YJC组独有菌属有18 个、YJCD 独有菌属有15 个、CD组独有菌属有25 个。从种水平分析YJC 组独有菌种有67 个、CD 组独有菌种有37 个、YJCD 独有菌种有23 个。
表1 菌种水平Alpha 多样性分析
Table 1 Species level Alpha diversity analysis
注：同行不同字母代表差异显著P＜0.05。
图2 产气食醋中物种在属（a）和种（b）分布Venn 图
Fig.2 Venn diagram of species distribution at genus（a）and species（b）in gas-producing vinegar
对产气食醋基因组进行物种注释，共鉴定出24 个门、42 个纲、94 个目、149 个科、233 个属、450 个种，其在属、种水平上的结果组成和丰度图3 所示。从属水平分析，丰度从大到小依次为98.69%醋酸乳杆菌属（Acetilactobacillus）、0.56%乳杆菌属（Lactobacillus）、0.35%顶乳杆菌属（Apilactobacillus）、0.12%厌氧杆菌属（Anoxybacillus）和0.10%慢乳杆菌属（Lentilactobacillus）。从种水平分析，丰度从大到小依次为98.69%金山醋酸乳杆菌（Acetilactobacillus jinshanensise）、0.41%乳酸杆菌（Lactobacillu sp.Sy-1）、0.12%新益顶乳杆菌（Apilactobacillusl xinyiensise）、0.12%厌氧芽孢杆菌（Anoxybacillus sp.KU2-611K）。Huang 等[16]通过基于宏基因组、宏转录组对醋发酵剂进行研究，表明金山醋酸乳杆菌为醋发酵剂的优势菌。对比YJC、CD、YJCD 3 组样品，金山醋酸乳杆菌的丰度均超过98%，其它微生物丰度均低于1%且几乎无差异，结合平板分离鉴定结果，表明金山醋酸乳杆菌是导致食醋产气的主要微生物。虽然其它乳杆菌及芽孢杆菌等存在于产气变质食醋中但是其相对丰度较低且未能从平板中分离出，故无法直接判断这些微生物与食醋产气变质是否有直接关联。与本文研究不同，孙文丽等[17]认为特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）是引起食醋胀气的潜在微生物。李盈颖等[18]对山西老陈醋产气样品进行微生物鉴定，认为引起山西老陈醋产气的微生物主要为头状葡萄球菌头状亚种（Staphylococcus capitis subsp.capitis），而其中少量芽孢杆菌处于休眠态，不是引起山西老陈醋产气的优势菌。
图3 产气食醋中细菌属（a）、种（b）水平物种相对丰度
Fig.3 Relative abundance of bacterial species at the genus（a）and species（b）in gas-producing vinegar
2.4 功能注释
2.4.1 Egg-NOG 数据库注释分析 将测序数据与Egg-NOG 数据库比对，获得各基因注释概况和主要COG 功能单元（表2 和图4）。本次共检测出2 176 个COG 功能单元，分别属于21 个主要功能大类，其中丰度大于5%主要为氨基酸转运和代谢（13.86%），翻译、核糖体结构和生物合成（13.85%），复制、重组和修复（9.20%），碳水化合物转运和代谢（8.77%），主要功能预测（8.73%），细胞壁/膜/被膜的生物合成（8.03%），核苷酸转运和代谢（5.92%），辅酶转运和代谢（5.29%）。丰度排名前20 的COG 功能单元主要涉及氨基酸转运和代谢，细胞壁/膜/被膜的生物合成，碳水化合物转运和代谢等。图5 为产气食醋中优势微生物对COG功能注释贡献度分析，结果表明金山醋酸乳杆菌对21 个COG 主要功能大类贡献率均大于93%，以上数据说明产气食醋的优势微生物-金山醋酸乳杆菌具有较强的抗逆性、能量代谢旺盛、繁殖能力强等特点。
表2 产气食醋微生物基因中主要COG 功能单元
Table 2 Main COG functional units in gas-producing vinegar genes
注：A.氨基酸转运和代谢；B.碳水化合物转运和代谢；C.辅酶转运和代谢；D.复制，重组和修复；E.细胞壁/膜/被膜的生物合成；F.翻译后修饰，蛋白质周转，分子伴侣；G.无机离子转运代谢；H.次级代谢物生物合成，转运和分解代谢；I.主要功能预测；J.信号转导机制；K.未命名蛋白。
图4 产气食醋微生物基因的COG 功能分类
Fig.4 Functional classification of COG in gas-producing vinegar
图5 产气食醋中优势微生物与COG 功能贡献度分析
Fig.5 Analysis of dominant microbe and COG functional contribution in gas-producing vinegar
2.4.2 KEGG 数据库注释分析 将3 个类型的9个产气食醋样品中的reads 匹配到KEGG 数据库中得到6 类共计46 个KEGG 通路，对富集度较高的通路进行注释，结果如图6 所示，在level 1 分类水平新陈代谢占比最高（65.57%），其次分别为遗传信息处理（15.22%）、环境信息处理（6.43%）、人体疾病（5.83%）、细胞过程（4.62%）、有机体系统（2.32%）；在level 2 分类水平中相对丰度占比高于4%的有全局和概览地图（26.38%）、碳水化合物代谢（7.75%）、氨基酸代谢（6.30%）、翻译（5.79%）、复制和修复（5.64%）、核苷酸代谢（5.64%）、辅助因子和维生素的代谢（4.59%）、能量代谢（4.26%）、膜运输（4.11%）。
图6 产气食醋微生物基因的KEGG 通路分析
Fig.6 KEGG pathway analysis in gas-producing vinegar genes
进一步对新陈代谢中富集度较高的氨基酸代谢、碳水化合物代谢、能量代谢以及脂类代谢与优势微生物进行贡献度分析和注释（如图7 和图8）。金山醋酸乳杆菌对氨基酸代谢、碳水化合物代谢、能量代谢、脂类代谢对贡献率分别为97.21%，98.51%，99.88%，99.96%，对上述代谢起主要贡献作用，也表明金山醋酸乳杆菌是产气食醋的绝对优势菌。在氨基酸代谢中丰度较高的为赖氨酸生物合成（1.10%）和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代谢（0.91%）。有研究表明生物体赖氨酸生物合成可以促进碱性物质的合成。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代谢可转胺催化氨的形成从而增强微生物的抗酸性，有利于微生物在食醋中存活[19]。在碳水化合物代谢中丰度较高的为丙酮酸代谢、氨基糖和核苷酸糖的代谢以及磷酸戊糖途径等。本课题组研究表明产气食醋中还原糖、丙酮酸含量下降而乳酸和乙酸含量增加[7]，这可能与金山醋酸乳杆菌碳水化合物代谢水平旺盛有关。Wu 等[20]研究山西老陈醋同样表明碳水化合物代谢中丰度较高的为淀粉和蔗糖代谢、丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生以及氨基糖和核苷酸糖代谢。在能量代谢中丰度较高的为氧化磷酸化，氧化磷酸化产生大量ATP，有利于细胞维持正常生命活动，抵御外界环境胁迫，从而有利于产气食醋中微生物进行生命活动[21]。在脂类代谢中，基因功能主要富集到甘油脂代谢和脂肪酸生物合成。乳酸菌可根据生长条件的变化改变细胞膜中脂肪酸组成，从而减少外界胁迫对细胞造成的损伤[22-23]。
图7 产气食醋中优势微生物与KEGG 通路level 2 贡献度分析
Fig.7 Analysis of dominant microbe and KEGG pathway level 2 contribution in gas-producing vinegar
图8 产气食醋微生物基因的KEGG 通路level 3 分析
Fig.8 KEGG pathway level 3 analysis in gas-producing vinegar genes
2.5 CAZy 数据库注释分析
根据Egg-NOG 数据库和KEGG 数据库注释信息显示，产气食醋中碳水化合物代谢水平较高，为进一步揭示其中碳水的代谢机制，采用CAZy数据库对主要碳水化合物活性酶进行注释（图9）。共注释到81 个不同的碳水化合物活性酶，分别为糖基转移酶（Glycosyl transferases，GT，占比35.901%）、碳水化合物酯酶（Carbohydrate esterases，CE，占比27.450%）、糖苷水解酶（Glycoside hydrolases，GH，占比22.408%）、辅助氧化还原酶（Auxiliary activities，AA，占比14.240%）、碳水化合物结合模块（Carbohydrate-binding modules，CBM，占比0.002%），未注释到多糖裂解酶，该酶在食醋中活性较低[24]。该结论与山西老陈醋醋醅中微生物碳水化合物注释存在差异，在山西老陈醋醋醅中糖基转移酶占比最高，其次为糖苷水解酶，碳水化合物结合模块、碳水化合物酯酶、辅助氧化还原酶、多糖裂解酶，存在这种差异的主要原因是醋醅中微生物组成与变质食醋存在较大差异[25]。
图9 产气食醋微生物基因的碳水化合物分析
Fig.9 Carbohydrate analysis in gas-producing vinear gene
注：GT2 包含GT2_Glyco_trans_2_3 和GT2_Glycos_transf_2；碳水化合物结合模块图中未体现。
在辅助活动模块家族中AA1 相对丰度最高占比达7.43%，具有漆酶（EC 1.10.3.2）、铁氧化物酶（EC 1.10.3.-）等酶活。碳水化合物酯酶家族中CE10 相对丰度最高，占比达15.86%，具有芳基酯酶（EC 3.1.1.-）、羧基酯酶（EC 3.1.1.3）、乙酰胆碱酯酶（EC 3.1.1.7）、胆碱酯酶（EC 3.1.1.8）等酶活。糖苷水解酶家族中GH25 相对丰度最高，占比达10.10%，具有溶菌酶（EC 3.2.1.17）活性。糖基转移酶家族中GT4 相对丰度最高为10.66%，具有蔗糖合酶（EC 2.4.1.13）、蔗糖磷酸合酶（EC 2.4.1.14）、α-葡萄糖基转移酶（EC 2.4.1.52）、脂多糖N-乙酰葡糖胺基转移酶（EC 2.4.1.56）、磷脂酰肌醇α-甘露糖基转移酶（EC 2.4.1.57）等酶活。
2.6 金山醋酸乳杆菌耐酸性及安全性分析
产气食醋具有较低的pH 值，金山醋酸乳杆菌作为其绝对优势菌，推测其具有较强的耐酸性。根据目前研究表明，乳酸菌的耐酸机制主要取决于细胞膜及胞外保护机制和细胞内调节机制[26]。具体可以划分为细胞内pH 值的调控、细胞膜脂肪酸组成调控、DNA 和蛋白质等生物大分子的修复和保护等方面。结合其他学者的研究和宏基因组测序数据对金山醋酸乳杆菌疑似耐酸基因进行分析，结果见表3。
表3 筛选的金山醋酸乳杆菌疑似耐酸基因
Table 3 Suspected acid-resistant genes screening in Acetilactobacillus jinshanensise
氨基酸是维持生命活动不可缺少的物质，是细胞正常生长的重要原料，近年来有不少研究证明氨基酸代谢在乳酸菌耐酸性方面发挥着重要作用[27]。arcA 调节精氨酸脱亚胺酶活性，促使乳酸菌利用精氨酸产生NH3，中和胞内H+，从而维持胞内pH 值相对平衡。除此以外谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸等氨基酸代谢也可以通过脱羧反应来消耗胞内H+，从而减少H+对细胞的损害[28]。
H+-ATPase 可以将ATP 的产生和质子动力势（Proton-motive force，PMF）偶联起来。PMF 能够促进细胞质中质子排出，有利于降低胞内pH值[29]。赵皓静[30]对耐酸乳杆菌耐酸性进行分析，发现酸胁迫后调节H+-ATPase 的相关基因（copB、cadA 和copA）表达水平显著提高。然而，在金山醋酸乳杆菌中仅copB 被注释，说明金山醋酸乳杆菌与耐酸乳杆菌耐酸机制存在一定的差别。
根据CARD 数据库及VFDB 毒力因子数据库注释可知，金山醋酸乳杆菌在标准毒力因子数据库中未匹配到大肠杆菌、单核细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌和肠杆菌属等常见致病菌毒力因子和耐药性，因此被该菌污染的食醋可采取热杀菌后重新进行灌装。上述注释结果表明该菌是一株不产生毒素的安全菌株，可用于食醋生产环节。孙佳[31]的研究表明表明金山醋酸乳杆菌用于食醋生产可以加快葡萄糖的消耗，缩短发酵周期，显著提高醋醅总酸、氨基酸和酯类物质含量。这与本课题组对产气食醋研究结果相一致，食醋产气变质后总糖与还原糖含量下降，总酸上升[12]。研究表明金山醋酸乳杆菌用于食醋发酵，在一定程度上可以促进食醋发酵产酸。Wang 等[7]对金山醋酸乳杆菌产气亚种研究表明该菌在65 ℃加热15 min 便可全部失活。然而，经热杀菌后储存于陈酿大罐中的食醋仍出现产气现象，罐管路污染是导致食醋出现产气变质的主要因素之一。陈菊等[32]对苹果醋污染关键环节进行分析表明，运输管道和储存罐中含有较多微生物，如果灭菌不彻底，可能会造成微生物污染。因此，在生产过程中应定期对罐管路、陈酿大罐进行清洗消毒，并对生产车间进行净化处理，才能有效防控食醋产气变质问题。
3 结论
食醋产气问题一直困扰着企业，导致企业生产效率的降低，严重损害企业利益。本试验采集产气食醋YJC、YJCD、CD 样品进行平板分离鉴定和宏基因组测序，并进行NR 数据库、Egg-NOG 数据库、KEGG 数据库、CAZy 数据库、CARD 数据库及VFDB 毒力因子数据库注释，并揭示了产气食醋中优势菌及相关功能性。
本试验研究表明产气食醋中的优势菌为金山醋酸乳杆菌，相对丰度占比达98.69%。Egg-NOG数据库、KEGG 数据库注释结果表明碳水化合物代谢、氨基酸代谢是产气食醋微生物最旺盛的代谢功能，两者一定程度上与微生物抵抗酸胁迫有关。CARD 数据库及VFDB 毒力因子数据注释可知，金山醋酸乳杆菌是一株不产毒素的安全菌株，可用于食醋发酵。结合KEGG 注释结果和其他学者研究对金山醋酸乳杆菌耐酸相关基因进行筛选，共筛选出13 个疑似耐酸基因，涉及氨基酸代谢、细胞膜脂肪酸组成、H+-ATPase 和双组分系统，后期可进一步结合宏转录组和宏蛋白组进行验证。论文研究结果为产气变质食醋中微生物的深入研究及其防控提供了理论依据。
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