传统臭鳜鱼是一种具有特殊风味的发酵鱼制品[1]，主要采用自然发酵方式[2]，发酵体系中蕴藏着丰富的微生物[3-4]，而微生物群落的生长代谢作用与臭鳜鱼风味和品质密切关联[5-7]。解析臭鳜鱼微生物群落结构及其代谢功能，对揭示臭鳜鱼风味和品质形成具有重要意义。
最早以传统培养为基础的微生物群落组成研究发现，乳酸菌在臭鳜鱼发酵过程中占有绝对优势，主要是格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）、乳酸乳球菌（Lactococcus latics）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）、布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）和食窦魏斯氏菌（Weissella cibaris）等[8-9]。Dai 等[9]通过传统培养分析臭鳜鱼中的细菌群落变化规律，发现细菌群落结构在整个发酵过程中变化显著，且清酒乳杆菌在自然发酵中、后期生长繁殖旺盛，具有数量上的绝对优势。
近年来，分子生物学各项技术被用于臭鳜鱼发酵体系研究，使臭鳜鱼中微生物菌群结构得到进一步解析。李燕等[10]采用变性梯度凝胶电泳技术研究臭鳜鱼在自然发酵过程中的微生物菌群结构，其中粪肠球菌、腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、溶酪大球菌（Macroboccus caseolyticus）等是发酵过程中的优势微生物。Shen 等[11]和Wang 等[12]利用高通量测序技术分析自然发酵臭鳜鱼中的微生物菌群结构，发现臭鳜鱼中主要含有弧菌属（Vibrio）、嗜冷杆菌属（Psychrobacer）和乳球菌属（Lactococcus）细菌，且不同发酵阶段的微生物群落结构存在明显差异。然而，目前这些研究多集中于臭鳜鱼发酵过程中的微生物群落结构组成，尚缺乏针对微生物群落的代谢功能研究，特别是利用生物信息学对臭鳜鱼发酵过程微生物群落的功能预测研究。
本研究以自然发酵臭鳜鱼为研究对象，采用高通量测序技术解析臭鳜鱼自然发酵过程细菌群落结构，并通过PICRUSt 菌群代谢功能预测工具对细菌功能进行预测，深入了解臭鳜鱼发酵过程中微生物的代谢功能差异，为臭鳜鱼发酵基础研究和工业化生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鳜鱼，购自池州市池一鱼有限公司，质量规格为500～600 g/尾；食用钠盐、花椒，合肥市庐阳区中菜市。
MagPure Soil DNA LQ Kit，美国Magen 公司；Qubit dsDNA Assay Kit，美国Life Technologies 公司；Tks Gflex DNA Polymerase，日本Takara 公司；细菌16S rRNA V3-V4 区扩增引物（343F：5’-TACGGRAGGCAGCAG-3’和798R：5’-AGGGTATCTAATCCT-3’），生工生物工程（上海）股份有限公司。其它试剂均为国产分析纯级。
1.2 设备与仪器
臭鳜鱼腌制发酵专用装置，本实验室自行设计[13]；Centrifuge5418 台式高速离心机，德国Eppendorf 公司；580BR10905 PCR 仪，美国Bio-rad公司；SN 002358 QIAxtractor，德国Qiagen 公司；HE-120 电泳仪，上海Tanon 公司；2500 凝胶成像仪，上海Tanon 公司；NanoDrop 2000 超微量分光光度计，美国ThemerFisher 公司；Illumina NovaSeq6000 高通量测序仪，美国Illumina 公司。
1.3 方法
1.3.1 臭鳜鱼样品制备 以新鲜鳜鱼为试验原料，参照前期试验方法[14]进行自然发酵，在发酵0，1，2，4，6，8，10，12，14，16 d 时采集样品，分别标记为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10，每个阶段各采集3 条臭鳜鱼。利用解剖刀在无菌操作条件下剔取鱼肉，并用绞肉机绞碎，待用。
1.3.2 DNA 提取 按照MagPure Soil DNA LQ Kit 说明对样品基因组DNA 进行提取，使用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop2000 对DNA 的浓度和纯度进行检测。
1.3.3 PCR 扩增及高通量测序 以基因组DNA为模板，细菌16S rDNA 的V3-V4 区343F 和798R 为上、下游引物，Tks Gflex DNA Polymerase进行第1 轮PCR 扩增。扩增体系：2×Gflex PCR Buffer 15 μL，5 pmol/μL F 1 μL，5 pmol/μL R 1 μL，基因组DNA 模板1 μL（50 ng），Tks Gflex DNA Polymerase（1.25 U/μL）0.6 μL，ddH2O 补足至30 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，26 个循环；72℃终延伸5 min。扩增产物经电泳检测后使用磁珠纯化，纯化后作为PCR 模板进行第2 轮PCR 扩增。扩增体系：2×Gflex PCR Buffer 15 μL，Adapter I5 1 μL，Adapter I7 1 μL，第1 轮PCR产物1 μL（50 ng），Tks Gflex DNA Polymerase（1.25 U/μL）0.6 μL，ddH2O 补足至30 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，7 个循环；72 ℃终延伸5 min。将第2 轮PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后切胶并利用Beckman 公司的Agencourt AMPure XP beads 纯化回收PCR 产物。最后对PCR产物进行Qubit 定量，根据PCR 产物浓度进行等量混样测序。测序由上海欧易生物医学科技有限公司完成。
1.3.4 生物信息学分析 原始数据为FASTQ 格式，使用Trimmomatic 软件对原始双端序列进行去杂。去杂后的双端序列利用FLASH 软件进行拼接，同时利用UCHIME 检测并去除序列中的嵌合体序列。得到的序列再使用VSEARCH 软件按照97%的相似度进行操作分类单元（Operational taxonomic units，OTU）聚类分析，最后用RDP classifier 贝叶斯算法比对Silva 16S rRNA 数据库（version138）进行OTU 序列的物种分类注释，并在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成。根据样品中各ASV 代表序列及其丰度表，使用PICRUSt2（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States 2）算法的标准集成基因组数据库推断16S rRNA基因序列定位到京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库进行注释，并通过PICRUSt2 算法预测群落的代谢途径丰度。
1.4 数据分析与处理
所有试验重复进行3 次。采用SPSS 16.0 软件进行单因素方差分析（ANOVA），P<0.05 为差异显著。采用Origin 2018 和Excel 绘制图表。
2 结果与讨论
2.1 臭鳜鱼发酵过程细菌OTU 分布特征
通过高通量测序技术对臭鳜鱼发酵过程30个样品的16S rRNA 基因V3-V4 区进行微生物菌群检测，共获得1 721 397 条有效序列，每个样品至少产生121 285 条有效序列，平均产生172 140条有序序列，平均长度在400～425 bp。通过OTU聚类，共产生5 128 个OTU 分类。维恩图直观地展示了臭鳜鱼发酵过程中细菌群落共有和特有的OTU 数目（图1）。由图1 可知，所有臭鳜鱼样品共有OTU 数量为39 个，发酵过程中，OTU 数量基本呈逐渐降低趋势，说明随着发酵时间的延长，臭鳜鱼中的微生物菌群结构变化明显，且微生物多样性逐渐降低。发酵前期，臭鳜鱼中的物种数占整个发酵过程总数比例较高，而发酵中期至发酵后期物种数下降明显，占总数比例低。从前期对风味的研究结果看，发酵前期和发酵中、后期臭鳜鱼的风味差距较大[14-15]。因此，推断发酵前期大部分物种对臭鳜鱼风味不起作用，发酵中、后期的共有物种及独有物种可能是影响臭鳜鱼风味的关键物种。
图1 臭鳜鱼发酵过程细菌群落维恩图
Fig.1 Venn map of bacteria communities in stinky mandarin fish during the fermentation
注：以S1.1、S1.2、S1.3 为例，分别代表3 个平行样品。
2.2 臭鳜鱼发酵过程细菌群落α-多样性分析
不同发酵阶段臭鳜鱼样品细菌群落的α-多样性测定结果见表1。由表1 可知，样品覆盖率均大于0.98，表明样品采集合理，测定结果可靠。在发酵过程中，Chao1 指数、Shannon 指数基本呈逐渐降低趋势，表明细菌群落丰富度和多样性均逐渐降低。这主要是由于发酵前期臭鳜鱼自身携带的微生物及接触到的环境微生物较多，随着发酵过程的进行，在低温和盐腌发酵条件下，发酵体系中的微生物代谢产酸，导致pH 值降低，使不耐酸和不耐低温的细菌生长受到抑制，从而逐渐减少或消失。
表1 臭鳜鱼细菌群落α-多样性测定结果
Table 1 Determination of α-diversity index of bacterial community of stinky mandarin fish
2.3 臭鳜鱼发酵过程细菌群落β-多样性分析
基于Bray curtis 距离对细菌群落进行PcoA分析。由图2a 可知，主成分PC1 和PC2 分别可以解释51.33%和23.41%的细菌群落结构变化，合计解释细菌群落结构变化74.74%。臭鳜鱼各发酵阶段平行样品之间距离较近，说明样品相似度较高，群落结构较一致，不同阶段样品之间呈现明显的分离状态且距离较远，说明菌群结构存在明显差异。由图2b 可知，不同发酵阶段的臭鳜鱼样品可以聚为3 类，S1、S2、S3 样品为1 类，即发酵0～2 d 的样品；S4、S5、S6 样品为1 类，即发酵4～8 d 的样品；S7、S8、S9、S10 样品为1 类，即发酵10～16 d的样品，与图2a 的结果一致，表明臭鳜鱼的发酵过程可以分为3 个阶段，即发酵前期（0～2 d）、发酵中期（4～8 d）和发酵后期（10～16 d），与前期研究结果一致[14]。
图2 臭鳜鱼细菌群落的PCoA 分析和聚类分析
Fig.2 PCoA and cluster analysis of bacterial community of stinky mandarin fish
2.4 臭鳜鱼发酵过程细菌群落结构分析
不同发酵阶段臭鳜鱼样品中细菌群落在种属水平上的组成如图3 所示。由图3a 可知，臭鳜鱼在发酵初期的优势菌属主要为未分类鼠杆菌科（Muribaculaceae）菌属、卡氏伯克霍尔德菌属（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）和埃希氏-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella），所占比例分别为14.91%，8.03%和3.66%；发酵中期的优势菌属为乳杆菌属（Lactobacillus）、嗜冷杆菌属和泛菌属（Pantoea），分别占44.15%，8.47%和10.69%；发酵后期则主要包含乳杆菌属、哈夫尼亚-肥杆菌属（Hafnia-Obesumbacterium）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、沙雷氏菌属（Serratia）和弧菌属细菌，分别占14.47%，14.87%，13.23%，12.09%和4.90%。发酵前期位居前3 的微生物菌属在发酵中、后期的含量明显降低，其它微生物菌属，如乳杆菌属虽然在整个发酵过程中均有体现，但在发酵中、后期相对丰度显著高于发酵前期，是构成发酵体系的优势微生物菌群。
图3 臭鳜鱼发酵过程中细菌群落在属、种水平上的分布
Fig.3 Distrubution of bacterial community in stinky mandarin fish during the fermentation at the genus and species level
由图3b 可知，臭鳜鱼在发酵初期的优势菌群为大肠杆菌（Escherichia coli），占比为5.92%；发酵中期的菌群主要包含清酒乳杆菌和消化嗜冷杆菌（Psychrobacter alimentarius），分别占43.43%和7.48%，而发酵后期则以清酒乳杆菌、蜂房哈夫尼亚菌（Hafnia alvei）、普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica）、留萌弧菌（Vibrio rumoiensis）等优势细菌为主，分别占13.94%，14.85%，12.06%和4.89%。清酒乳杆菌在发酵初期相对丰度较低，至发酵中期相对丰度明显增加，并成为发酵体系中的优势菌群，至发酵后期相对丰度虽然有所下降，但仍然是发酵体系中的主要优势菌群之一，提示清酒乳杆菌在自然发酵臭鳜鱼中占据主导地位，与李燕[3]对自然发酵臭鳜鱼微生物菌群组成的研究结果一致。
通过主成分分析（PCA）更直观得到细菌群落和不同发酵阶段样品之间的关系（图4）。图4 明确发酵前期菌群主要为卡氏伯克霍尔德菌属、埃希氏-志贺氏菌属等，发酵中期菌群主要为乳杆菌属、嗜冷杆菌属和泛菌属细菌，其中清酒乳杆菌和消化嗜冷杆菌是主要的优势菌，发酵后期的菌群主要为乳杆菌属、弧菌属、沙雷氏菌属、柠檬酸杆菌属、变形杆菌属、沙雷氏菌属和假单胞菌属细菌，如清酒乳杆菌、蜂房哈夫尼亚菌、留萌弧菌、普城沙雷氏菌。这些结果表明，臭鳜鱼的发酵过程是一个动态变化的过程，发酵环境的改变导致了发酵过程中微生物群落结构产生明显差异。
图4 臭鳜鱼发酵过程中细菌群落主成分分析
Fig.4 Pricipal component analysis of bacterial community during fermentation of stinky mandarin fish
传统臭鳜鱼发酵是一个多菌种共同作用的自然发酵过程，鱼体是其发酵微生物的主要来源。埃希氏菌属、嗜冷杆菌属细菌是鳜鱼自身易携带的微生物，其它菌属如弧菌属、假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）、哈夫尼亚菌属和希瓦氏菌属（Shewanella）细菌也在鳜鱼中大量存在[13]。这些细菌是鱼类及其发酵制品中常见的腐败微生物[16-19]，严重影响产品质量和安全。微生物接种发酵是改善发酵鱼制品品质的有效途径之一[20-23]。用于接种发酵的微生物通常是从自然发酵制品中分离获得，包括细菌和真菌[24]，而传统上乳酸菌是许多发酵鱼制品中的优势微生物，分离到的乳酸菌主要包括清酒乳杆菌[25]、短乳杆菌（L.breris）[26]、发酵乳杆菌（L.fermentum）[27-29]、植物乳杆菌（L.plantarum）[30]和乳酸乳球菌（L.lactis）[8]等，对发酵鱼制品风味和品质形成具有重要贡献。本研究通过高通量测序技术研究臭鳜鱼菌群组成得出，清酒乳杆菌是臭鳜鱼中的优势乳酸菌类群，这为臭鳜鱼工业化生产用发酵剂的研发提供了良好的菌种资源。
2.5 臭鳜鱼发酵过程细菌群落功能预测
为了解臭鳜鱼发酵过程中微生物菌群的潜在功能，借助KEGG 功能注释数据库，使用PICRUSt 软件对16S rRNA 测序结果进行细菌群落功能预测，得到COG 功能相对丰度（图5）和KEGG 通路相对丰度（图6）。
图5 COG 功能预测分析
Fig.5 COG function prediction
图6 臭鳜鱼发酵过程细菌群落的代谢通路分析
Fig.6 Metabolic pathway analysis of microbial community in stinky mandarin fish during the fermentation
通过PICRUSt 功能预测，从臭鳜鱼样品中共分析得到4 441 个COG，忽略未知功能的COG，其它则隶属于24 个功能类别。由图5 可知，一般功能预测（R 类，11.00%～11.63%），氨基酸运输与代谢（E 类，7.80%～9.35%），转录（K 类，7.91%～8.92%），碳水化合物转运代谢（G 类，7.35%～9.20%），细胞壁/膜/被膜生物合成（M 类，5.67%～6.89%），转录、核糖结构和生物转化（J 类，5.22%～6.72%），能量生成和转化（C 类，5.13%～5.70%），复制、重组和修复（L 类，4.80%～6.17%）以及无机离子转运和代谢（P 类，4.69%～5.64%）功能在臭鳜鱼中表现较高的丰度，且这9 类主要功能相对丰度总和在50%以上，其中一般功能预测相对丰度最高，其次是氨基酸运输与代谢，转录、碳水化合物转运与代谢。氨基酸运输与代谢相对丰度在发酵过程中的排序为：发酵前期<发酵中期<发酵后期，转录、碳水化合物转运与代谢相对丰度在发酵过程中的排序均为：发酵前期>发酵中期≈发酵后期。其它COG 功能，如信号转到机制（T 类，4.22%～5.89%），辅酶转运和代谢（H 类，3.85%～4.22%），转录后修饰、蛋白伴侣（O 类，3.10%～3.51%），脂肪转运和代谢（I 类，2.68%～3.21%）以及核苷酸转运和代谢（F 类，2.57%～3.40%）等在臭鳜鱼中的相对丰度则较低。
COG 功能预测结果表明，在臭鳜鱼所有代谢途径中，碳水化合物转运代谢、氨基酸运输与代谢最为活跃，且与风味物质形成密切相关，发酵中、后期是臭鳜鱼中微生物生成氨基酸类物质并进一步代谢转化成小分子风味物质的主要阶段。研究发现多数乳酸菌如清酒乳杆菌、植物乳杆菌、德氏乳杆菌（L.delbrueckii）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、乳酸片球菌（P.acidilactici）、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、乳酸乳球菌等均具有产氨基酸的能力[31-34]。结合图2b 显示臭鳜鱼发酵中、后期清酒乳杆菌丰度较高，推测其对臭鳜鱼中风味物质的形成具有重要作用。
通过PICRUSt 软件对臭鳜鱼发酵过程中的细菌菌群结构进行功能预测，在KEGG 数据库中共注释到6 类一级代谢通路，其中代谢、遗传信息处理和环境信息处理是臭鳜鱼菌群主要的代谢通路，这3 类代谢通路在发酵过程中的丰度值排序均为：发酵前期<发酵中、后期，在所有代谢通路中的相对丰度分别为43.24%～48.36%、15.96%～19.00%和13.69%～18.60%（图6a）。注释到41 类二级代谢通路，其中属于上述3 类通路的二级代谢通路相对丰度均大于0.1%。臭鳜鱼发酵过程中的微生物菌群代谢途径主要富集在碳水化合物代谢（9.23%～11.14%）、氨基酸代谢（8.16%～9.75%）、能量代谢（4.64%～5.95%）、复制和修复（6.74%～8.48%）、翻译（4.09%～5.45%）、膜运输（11.75%～16.12%）等通路（图6b）。具体来讲，碳水化合物代谢主要包括三羧酸循环、糖酵解和磷酸戊糖途径等，氨基酸代谢主要包括半胱氨酸和蛋氨酸代谢、赖氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等（图6c）。在臭鳜鱼发酵体系中，鱼体为微生物生长代谢提供基质，微生物通过碳水化合物代谢、氨基酸代谢等途径将糖类、蛋白质、脂质等大分子物质先分解为有机酸、小肽和氨基酸类物质，再进一步代谢为醇类、醛类、酸类和酯类等小分子风味物质。各发酵阶段菌群三级代谢功能无显著差异，表明臭鳜鱼中的微生物菌群结构虽然在发酵过程中不断变化，而微生物发挥的主体代谢功能较一致，发酵过程中受影响的细菌群落代谢功能可能存在于未知部分。
3 结论
本文通过高通量测序揭示了臭鳜鱼发酵过程中微生物群落结构的变化规律，发现不同发酵阶段微生物群落结构存在显著差异。发酵中期和发酵后期的优势菌群丰度均高于发酵前期，且结构较相似。发酵前期表现为病原微生物较多，发酵后期则表现为优势物种更突出，且以乳杆菌属细菌为主，占绝对优势的乳酸菌为清酒乳杆菌。清酒乳杆菌可能是自然发酵臭鳜鱼中的关键微生物，对臭鳜鱼风味品质的形成起到重要作用。通过细菌群落代谢功能预测，发现碳水化合物代谢和氨基酸代谢的相对丰度最大，这两类代谢是臭鳜鱼风味物质形成的主要动力来源，发酵中、后期的细菌群落结构对臭鳜鱼风味品质形成更为有利。
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