γ-癸内酯和δ-癸内酯具有水果香味、椰子、桃子和甜奶油等风味，被广泛用于焙烤食品、饮料以及糖果中[1-2]。其不同对映异构体具有不同的香气特征[3-5]（表1）。γ-癸内酯又称丙位癸内酯，是含有五元环的内酯，其R-型异构体具有强烈的水果味和脂甜味，S-型异构体具有柔和的脂甜味和椰奶味，其在水中的阈值为11 μg/kg。δ-癸内酯又称丁位癸内酯，是一种饱和的六环内酯，其R-型异构体具有甜味、果味、椰子味，S-型异构体具有甜奶味、黄油味和脂肪味，在水中的阈值为8 μg/kg [6]。
表1 γ-和δ-癸内酯的对映异构体和香气特征
Tab.e 1 Enantiomers and aroma characteristics of γ-decalactone and δ-decalactone
γ-癸内酯和δ-癸内酯的制备方法主要有天然产物提取法、化学合成法和生物合成法。
天然产物提取是通过有机萃取、水蒸气蒸馏等技术从植物和果蔬食品中获取癸内酯，但存在天然含量低、原料基质复杂等缺陷。此外，不同食品中癸内酯的手性异构体（R∶S）比例存在显著差异（表2）[7-9]，并且复杂的分离纯化工艺导致成本高。
表2 不同食品中γ-癸内酯和δ-癸内酯的手性异构体比例
Tab.e 2 The ratio of chiral isomers of δ-decalactone and γ-decalactone in different foods
化学合成法主要有3种途径：一是羟基酸、羟基酯和羟基衍生物在盐酸、硫酸、对甲苯磺酰氯等催化剂的作用下转化为内酯；二是ω-癸烯酸在硫酸的作用下异构化形成β、γ-不饱和癸烯酸，再通过加热和硫酸的作用形成内酯；三是以醇为原料，脱水反应形成烯烃，再进一步形成内酯[10-12]。化学法合成法效率虽高，但产物为消旋体，其风味与天然癸内酯存在一定差距。此外，其制备过程涉及大量的有机溶剂，不仅对环境不友好，还存在安全隐患。
生物合成法则可克服以上缺陷，它利用微生物体内的酶系，通过次级代谢作用来合成癸内酯[4]。所获产物不仅具有旋光性，而且制备条件对环境友好，产物更加天然和绿色。然而，该法存在底物和产物抑制，生产效率低下，从而限制了工业化生产。
本文综述γ-癸内酯和δ-癸内酯的生物合成途径，总结内酯化合物的细胞毒性机制及其调控方式，以期为提高生物合成癸内酯的效率提供借鉴。
1 生物合成癸内酯的方法
生物法合成癸内酯的途径主要有3步：首先，脂肪酸在转运蛋白、脂酰辅酶A结合蛋白或脂肪酸结合蛋白的作用下进入线粒体；然后，在线粒体内通过脂肪酸的β-氧化缩短碳链后形成羟基脂肪酸；最后，羟基脂肪酸在环化酶作用下发生内酯化反应形成环状化合物的途径（图1）。但是，内酯积累到一定程度之后会在内酯酶的作用下降解为ω-二羧酸[13]。
图1 生物法合成癸内酯的途径
Fig.1 Biosynthesis of decalactone
1.1 微生物次生代谢合成
微生物次生代谢合成是指微生物能通过自身代谢而合成内酯。Muys等[14]首次发现细菌（藤黄八叠球菌（Sarcina lutea））、酵母（假丝酵母属（Candida）、酵母属（Saccharomyces））和霉菌（点青霉（Penicillium notatum）、酪酸枝孢霉（Cladosporium butyri）、芳香枝孢霉（Cl.suaveolens））等均可利用自身代谢合成光学活性的γ-癸内酯和δ-癸内酯。Albrecht等[15]报道香味掷孢酵母（Sporobolomyces odorus）可利用自身代谢合成δ-癸内酯。Welsh等[16]发现硬多孔菌（Polyporus durus）、假热带假丝酵母（C.pseudotropicalis）和酪酸枝孢霉等微生物均能合成γ-癸内酯和δ-癸内酯。表3总结了可通过次生代谢合成的内酯的微生物。
表3 微生物次生代谢合成内酯
Tab.e 3 Synthesis of lactones by microbial secondary metabolism
1.2 以马索亚内酯为底物
当底物为（R）-（-）-马索亚内酯时，烯还原酶可将其内环碳碳双键还原，生成（R）-（+）-δ-癸内酯[23]（如图2）。Rabenhorst等[24]学者研究发现酵母菌属、假单胞菌属和芽孢杆菌属等均可将马索亚内酯还原为（R）-（+）-δ-癸内酯，其中恶臭单假胞菌ATCC 33015的转化率可达99.1%。Ewa等[3]学者将来源于酿酒酵母的烯还原酶OYE3在大肠杆菌中表达，采用连续填料床生物反应器，马索亚内酯的转化率达到99%以上。但是马索亚内酯来源于马索亚树皮中，而马索亚树产地不多且产量低，导致马索亚内酯售价高达约8 000元/kg，故该方法原料昂贵且难以获得，不适合用于工业化生产。
图2 烯还原酶催化还原（R）-（-）-马索亚内酯合成（R）-（+）-δ-癸内酯
Fig.2 The synthesis of（R）-（+）-δ-decalactone by the reduction of（R）-（-）-massoia lactone catalyzed by ene reductase
1.3 以γ-酮酸/酯和δ-酮酸/酯为底物
γ-酮酸/酯和δ-酮酸/酯可在羰基还原酶的作用下，可不对称还原成相应的手性羟基酸/酯，再通过内酯化作用，生成γ-癸内酯和δ-癸内酯[22-23]（图3）。
图3 羰基还原酶催化γ-酮酸/酯和δ-酮酸/酯还原合成手性羟基酸/酯和癸内酯
Fig.3 Carbonyl reductase catalyzes the reduction of γ-ketoacids/esters and δ-ketoacids/esters to synthesize chiral hydroxyl acids/esters and decalactones
Welsh等[16]首次报道了分别以4-氧代癸酸和5-氧代癸酸为底物，经过细菌或真菌还原形成相应的羟基脂肪酸，最后环化形成内酯（图4）。其中，酿酒酵母还原5-氧代癸酸可得到0.355 g/L的δ-癸内酯，转化率高达85%。
图4 氧代癸酸生物转化为癸内酯
Fig.4 Oxydecanoic acid is biologically converted to decyllactone
利用蛋白质工程对羰基还原酶SmCR进行分子改造实现定向进化，可大大提高γ-癸内酯和δ-癸内酯的反应效率。Zhang等[25]学者首次报道一种来自粘质沙雷氏菌的羰基还原酶SmCR，可以高对映选择地还原长链酮酸/酯如4-氧代癸酸/酯和5-氧代癸酸/酯的γ-羰基和δ-羰基，最后分别获得e.e.值为95%、产率为72%～79%的（R）-δ-癸内酯和（R）-γ-癸内酯。陈梦[26]通过对羰基还原酶SmCR进行随机突变和半理性改造手段后，获得突变体SmCRv4，其催化获得（R）-γ-癸内酯和（R）-δ-癸内酯的时空产率分别从8.8 g/L/d提高到83 g/L/d和56 g/L/d。
Ren等[27]学者将酿酒酵母中的羰基还原酶基因OdCR1和OdCR2在大肠杆菌中表达，发现这两种酶都能不对称地还原酮酸/酯中的γ-羰基和δ-羰基。通过研究两种酶的底物特异性，发现OdCR2可以高选择地还原4-氧代癸酸和5-氧代癸酸，分别生成e.e.值为99%、产率为85%的（R）-γ-癸内酯和e.e.值为98%、产率为92%的（R）-δ-癸内酯。
1.4 以脂肪酸为底物
脂肪酸需要通过羟基化、β-氧化和内酯化等步骤转化为γ-癸内酯和δ-癸内酯，以不同的脂肪酸为底物合成的γ-癸内酯和δ-癸内酯途径也会不同[28]。
1.4.1 以羟基脂肪酸为底物 目前合成癸内酯的羟基脂肪酸大多数以蓖麻油酸为主。早在1963年，Okui等[29]报道了以蓖麻油酸为底物，通过假丝酵母发酵培养后，经过4次β-氧化后得到4-羟基癸酸，再经分子间内酯化成γ-癸内酯（图5）。
图5 蓖麻油酸生物转化为γ-癸内酯
Fig.5 Bioconversion of ricinoleic acid to γ-decalactone
1.4.2 以非羟基脂肪酸为底物 目前报道合成癸内酯的非羟基脂肪酸有癸酸、亚油酸。Manning等[30]报道了癸酸在来源于嗜热嗜微温菌（Tepidiphilus thermophilus）的细胞色素P450单氧化酶催化作用下，羟基化为（S）-5-羟基癸酸，再通过内酯化变成（S）-（-）-δ-癸内酯，e.e.值可达到90%以上（图6）。
图6 癸酸生物转化为（S）-（-）-δ-癸内酯
Fig.6 Bioconversion of decanoic acid to（S）-（-）-δ-decalactone
Oh等[31]报道以亚油酸为底物，通过多步反应合成δ-癸内酯。首先，亚油酸在嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）的亚油酸双键水合酶作用下，转化为13-羟基-9-十八碳烯酸，将其分离纯化后，再通过β-氧化和内酯化进一步作用，可得到0.7 g/L的δ-癸内酯（图7）。
图7 亚油酸生物转化为δ-癸内酯
Fig.7 Bioconversion of linoleic acid to δ-decalactone
Kang等[32]则发现，通过一锅法也可以合成δ-癸内酯，即多步反应在同一个反应容器内完成，而无须中间体产物的分离、纯化。在含有亚油酸的反应体系中，首先添加来源于嗜酸乳杆菌的亚油酸双键水合酶，反应生成13-羟基-9-十八碳烯酸后，再添加解脂耶氏酵母进行转化，最后可得到1.9 g/L的δ-癸内酯。
Zia等[33]以亚油酸含量较高的葡萄籽油为底物，分别采用类谷糠乳杆菌FAM-1079、乳酸乳球菌乳酸亚种FAM-17918、乳酸乳球菌乳脂双乙酰亚种FAM-22003等乳酸菌进行单菌发酵，合成的δ-癸内酯产量在0.053～0.266 mg/L范围之间。在该反应体系中，葡萄籽油既可作为底物，还能作为溶剂原位捕获内酯，减弱对乳酸菌细胞的毒性。
可见，通过微生物次生代谢合成癸内酯，虽然原料来源丰富、成本低，但其产量太低；以马索尔内酯和γ-酮酸/酯和δ-酮酸/酯为底物合成癸内酯的转化率虽然可达85%，但其原料昂贵，导致成本太高；以酮酸或脂肪酸为底物时，则需通过羰基还原酶先将它们转化成相应的羟基脂肪酸，但是羰基还原酶难以获得。因此，以上几种方法均不适合工业化生产。为了提高生物合成癸内酯的效率，下面综述了癸内酯等芳香化合物对微生物细胞的毒性机制和调控策略，以期为此类化合物的工业化生产提供理论依据和参考。
2 芳香化合物的细胞毒性及其作用机制
2.1 对细胞生长的影响
内酯化合物对微生物细胞具有抑制作用。Nago等[34]研究了微生物在含有不同质量浓度（100～400 mg/L）马索亚内酯的固体培养基上生长情况。结果表明，当马索亚内酯的质量浓度为100 mg/L时，能抑制大部分细菌的生长，但在木霉属（Trichoderma）、镰刀菌属（Fusarium）、毛霉属（Mucor）和青霉属（Penicillium）等菌株则能耐受400 mg/L的马索亚内酯。Bonnarme等[35]研究发现6-戊基-α-吡喃酮（6PP）对木霉菌的生长有抑制作用，当6PP的质量浓度从50 mg/L升至300 mg/L，木霉菌的生长直径从12 cm降到1 cm；当6PP的质量浓度为400 mg/L时，木霉菌停止生长。
Aguedo等[36]研究发现，当γ-癸内酯的质量浓度为100 mg/L时，30 h后解脂耶氏酵母的生长达到稳定期；当γ-癸内酯的质量浓度升至150 mg/L时，生长速率显著降低，35 h后才达到稳定期；而当γ-癸内酯的质量浓度为300 mg/L时，酵母细胞停止生长。可见内酯浓度高于150 mg/L时，酵母细胞的生长会受到抑制。
2.2 对细胞膜流动性的影响
研究发现芳香化合物可能通过影响细胞H+-ATP酶活性、细胞膜的组成和结构等，进而影响细胞膜的流动性。
Aguedo等[36]采用荧光偏振法测定细胞膜的流动性，发现当γ-癸内酯浓度从0提高到300 mg/L时，酵母细胞的荧光各向异性从0.15降到0.11，细胞膜的流动性随之升高。此外，H+-ATP酶活性从100%降到了20%，酵母细胞对营养物质的吸收和离子跨膜运输能力受到抑制。
Alexandre等[37]研究发现底物癸酸通过影响微生物细胞膜的脂肪酸组成来增大细胞膜的流动性。随着癸酸浓度的增加，细胞膜上甾醇组成发生了变化，麦角甾醇和羊毛甾醇的占比提高，约为对照组的2倍；磷脂脂肪酸组成也发生改变，C16∶1的含量下降70%，C18∶1的含量增加了65%，使得生长的细胞表现出更大的膜流动性。
此外，内酯化合物对细胞的毒性还可能与其对细胞膜组成和结构的影响密切相关。Enomoto等[38]通过测量荧光强度的变化研究芳香化合物对膜电位的影响，发现紫罗兰酮和乙酸戊酯等芳香化合物能与膜脂相互作用导致膜电位变大，进而增加细胞膜的流动性。Bouchard等[39]采用傅里叶变换红外光谱和氘核磁共振光谱研究β-紫罗兰酮和薄荷酮等芳香化合物对膜流动性的影响。红外光谱结果发现β-紫罗兰酮和薄荷酮的掺入会降低脂酰基链的顺序、凝胶相到脂质相的相变温度以及相变协同性。氘核磁共振光谱结果发现β-紫罗兰酮和薄荷酮的掺入会导致位于脂酰基链中心和尾部区域中氘子的四极分裂减少。
3 提高生物法合成内酯效率的调控策略
3.1 菌种诱变及选育
菌株诱变技术使得微生物遗传物质DNA结构发生稳定的可遗传变化，可获得具有优良性能的菌株。宋焕禄等[40]对鲑色锁掷孢酵母进行紫外诱变，使γ-癸内酯的产量从0.097 g/L提高到6.009 g/L；王聪等[41]采用硫酸二乙酯化学诱变剂结合紫外诱变的方法，对解脂耶氏酵母进行诱变，使得γ-癸内酯的产量提高到初始菌株的2.3倍，达到0.375 g/L；徐勤[42]筛选一株产γ-癸内酯的毕赤酵母，并对其原生质体进行紫外诱变，γ-癸内酯产量比初始菌株提高了28.85%，达到1.25 g/L。本实验室筛选到一株葡萄牙棒孢酵母，能催化蓖麻油酸合成（R）-γ-癸内酯，通过室温等离子体诱变菌株，其产量是出发菌株的1.75倍，达到2.37 g/L。
3.2 基因改造
通过基因工程手段对微生物进行改造，通过过表达或敲除微生物的部分基因片段，改变关键酶的活力，可增加内酯的产量。解脂耶氏酵母具有一个基因家族，编码6个酰基CoA氧化酶（Aox l-Aox 6），基因对应命名为POX1-POX6，它们在脂肪酸的β-氧化中发挥着重要的作用。Aox2对长链脂肪酸有很强的特异性，有利于蓖麻油酸产生癸内酯的生物转化；Aox3则对短链脂肪酸有较强的特异性，参与内酯的降解过程，会降低内酯的产量[13]。
Guo等[43]研究发现POX2、POX3基因对催化合成γ-癸内酯十分重要。通过过表达POX2基因和敲除POX3基因，所构建的基因工程菌催化蓖麻油酸甲酯，获得γ-癸内酯的产量从0.9 g/L增加到3.3 g/L。刘莎[44]通过敲除编码酰基CoA氧化酶的POX3基因构建新的基因工程菌，其催化蓖麻油酸发酵生产γ-癸内酯的产量是初始菌株的2.53倍，达到3.373 g/L。
3.3 优化发酵条件
为了削弱底物的抑制作用，Gomes等[45]以蓖麻油酸甲酯为底物生产γ-癸内酯，研究了传统分批发酵、恒定速率补料发酵和间歇补料等发酵方式的生产效率。结果发现采用传统分批发酵γ-癸内酯的转化效率高达168 mg/L/h，但是产量只有1.9 g/L，其它两种发酵方式的转化效率虽然只有40～43 mg/L/h，但间歇补料发酵的产量可高达6.8 g/L。
由于内酯的生成过程中会涉及β-氧化过程，在反应过程中增加发酵体系的溶氧水平，提高氧气传质效率，有利于提高微生物细胞对底物的利用率。Kalyani等[46]研究了表面和深层发酵条件下6PP的合成过程。在表面发酵条件下，最高产量可达到455 mg/L，但在深层发酵条件下，最高产量仅为167 mg/L。Belo等[47]研究了在发酵罐中，用解脂耶氏酵母W29催化蓖麻油合成γ-癸内酯，结果发现，当搅拌速率和空气流量从400 r/min和1.7 L/h分别提高至650 r/min和5.1 L/h时，生产速率从16 mg/L/h提高到75 mg/L/h。
3.4 固定化技术
将微生物进行固定化，不仅有利于产物的分离和纯化，还能对细胞起到保护作用，在一定程度上减少产物抑制。林芳等[48]通过聚乙烯醇和卡拉胶将解脂耶氏酵母进行固定化，使得γ-癸内酯的产量达到0.48 g/L，较之游离细胞提高了1.68倍。赵玉萍[49]采用海藻酸钠复合凹凸棒石黏土固定化解脂耶氏酵母G3-3.21生产γ-癸内酯，其最高产量是游离细胞高1.32倍，达到6.15 g/L，重复利用4次，其相对活性几乎没有丧失，仍保持在93.5%。何华英[50]将酵母细胞MF-Y11固定在细菌纤维素（BC）和海藻酸钠（ALG）上制备γ-癸内酯，该BCALG载体可以重复利用5次，得到最大产量为8.37 g/L，相对活性可达87.6%。Braga等[51]研究采用聚丙烯酸甲酯固定化解脂耶氏酵母细胞，与游离细胞相比，γ-癸内酯的产量从9.54 g/L提升到15.97 g/L。
3.5 原位捕获
原位捕获技术主要通过树脂等材料对内酯进行吸附，或者通过有机溶剂、离子液体等介质将底物和产物进行相转移，不仅可以缓解底物和产物对微生物的毒害或抑制作用，还有利于产物的分离和纯化。
采用树脂对产物进行吸附可在一定程度上减少产物抑制。于伟等[52]以蓖麻油酸为底物，添加树脂AB-8吸附产物以降低其在转化液中的浓度，减少对解脂耶氏酵母细胞的毒性，将γ-癸内酯产量从1.13 g/L提高至2.17 g/L。
采用非极性有机溶剂建立双相体系是常见的手段。王梦泽[53]利用蓖麻油酸与活性酵母MF-Y11进行生物转化制备γ-癸内酯，研究不同非极性有机溶剂对生物转化γ-癸内酯的影响，发现采用环戊硅氧烷和环己硅氧烷进行相转移，可降低蓖麻油酸和γ-癸内酯在水相中的浓度，使产量达到7.08 g/L，较之对照提高了68.17%。李元芳等[54]采用解脂耶氏酵母，以蓖麻油为底物生物转化制备γ-癸内酯，在生物转化的过程中添加有机溶剂十四酸异丙酯或十六酸异丙酯形成双相体系，减小水相体系中的产物浓度，使得γ-癸内酯的产量最高可达5.44 g/L，比单水相体系提高了5.4倍。
由于离子液体较之有机溶剂有更好的生物相容性，将离子液体等绿色介质引入双相体系也是研究热点[55]。赵玉萍[49]将生物相容性较好的离子液体引入研究中，将固定化细胞在含有N-丁基吡啶四氟硼酸盐（[BPy]BF4）反应体系中，γ-癸内酯的产量可达到7.85 g/L，比对照体系高1.28倍。
本实验室研究发现在含离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（C4MIM·PF6）的双相体系中，葡萄牙棒孢酵母YJ26-35a细胞催化合成（R）-γ-癸内酯产量为2.04 g/L，是水相体系的2.37倍。在7.5%的最适底物浓度下，含离子液体双相体系的产量为1.3 g/L，比水相体系提高50%。
可见，含离子液体双相体系能够降低产物在水相体系中的浓度，有效缓解反应体系中高毒性物质对微生物的抑制作用，进而提高产物的生产效率。
3.6 其它
在水相体系中，由于底物蓖麻油酸难溶于水，导致其利用率较为低下。何华英[50]采用表面活性剂脂肽调节蓖麻油酸液滴粒径的大小，研究发现，蓖麻油酸液滴粒径约为3 μm时，蓖麻油酸的转化率从27.16%提高到 29.94%，γ-癸内酯的产量最高可达2.25 g/L。本实验室利用葡萄牙棒孢酵母催化蓖麻油酸合成（R）-γ-癸内酯，添加表面活性剂吐温-80之后，产量提高至原来的2.3倍。
4 结论与展望
目前，随着社会的发展，消费者崇尚自然，天然香精香料十分符合消费者的需求。通过生物法制备的癸内酯属于天然香基，应用前景广泛，但其会对产物细胞具有毒性作用，限制了未来应用发展。目前对于癸内酯的胁迫耐受机制及其对细胞毒性影响方面的研究较少，未来可以从癸内酯对细胞生物膜组分的影响、对膜生物物理性质的影响、对细胞钙稳态的影响、对生物大分子的氧化损伤等方面进行深入研究，解析该类化合物的毒性作用机制，为探索提高其耐受性方法提供科学参考。此外，通过生物法，合成具有天然手性配比的癸内酯目前尚无突破，这也值得研究者进行更深入的研究。
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