为研究果酒酵母菌混合培养条件下生长状态的变化规律及挥发性风味物质成分，选取前期筛选获得的3种酵母菌：酿酒酵母131（简称Sc）、东方伊萨酵母65（简称Pf）和毕氏酵母166（简称Io），考察不同混合培养方式的酵母菌菌种的生长变化情况，并通过气相色谱-质谱（GC-MS）分析方法比较挥发性风味物质组成的差异性。结果表明，相对于纯培养，两两混合培养时，非酿酒酵母Pf和Io均对酿酒酵母Sc产生明显的抑制作用，且Sc受Pf抑制更明显；3种酵母菌混合培养时，Pf占优势地位，Io受到一定程度的抑制，Sc受抑制的程度严重。对挥发性风味成分分析，共检测到57种挥发性物质成分，其中醇类16种、醛类5种、酯类19种、酮类7种、酸类4种和其它6种。两两混合培养时的风味物质组成和非酿酒酵母单独培养时的相似度较高，相对含量比例最高的是醇类和酯类，其中醇类含量较高的依次为乙醇、异戊醇、2-甲基-1-丁醇和苯乙醇，酯类含量较高的为乙酸乙酯和乙酸异戊酯。三者混合培养时醇类相对含量有所下降，占41.32%，酯类相对含量显著增加，达56.34%，其中含量较高的是乙酸乙酯（32.15%）、乙酸异戊酯（11.72%）、乙酸苯乙酯（3.71%）和乙酸丙酯（2.68%），均高于纯培养或两菌混合培养的，大大增强了果酒发酵的特殊风味。此外，发现酚类、吡嗪及含硫化合物，它们共同构成果酒发酵独特的风味。本研究结果为果酒多菌种发酵工艺确定及品质控制提供理论基础。