以实验室自制蛋黄卵磷脂（PC）粗品为原料，采用中性氧化铝柱层析分离技术，制备高纯度蛋黄多不饱和脂肪酸卵磷脂（PC≥90%）。分别考察固定相粒径、洗脱液浓度、上样浓度、洗脱液流速、上样量等对氧化铝层析柱纯化蛋黄卵磷脂过程中的影响，同时采用薄层层析定性和高效液相色谱定量跟踪分析，采用气相色谱对所得样品脂肪酸种类及组成进行分析。最佳工艺条件：氧化铝粒径为100～200目、95%乙醇洗脱液、上样浓度1 ∶ 4（m/V）、洗脱流速8 mL/min、色谱柱负载量0.0222 g/g氧化铝；在最优条件下，高纯度蛋黄卵磷脂（PC≥90%）得率可达84.43%，一段PC产品的DHA含量高达13.35%。本试验可为工业化制备高纯度多不饱和脂肪酸卵磷脂提供技术参考。